抑菌环试验方法详解：原理、操作步骤与评价标准

抑菌环试验方法详解：原理、操作步骤与评价标准

抑菌环试验，又称为纸片扩散法，是一种用于评估抑菌剂与溶出性抗（抑）菌产品对细菌抑菌效果的实验方法。该方法通过观察抑菌圈的大小来判断抗菌剂的抑菌效果，具有直观性和便捷性的特点。

抑菌环试验原理

利用抑菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度，以显示其抑菌作用。试验通过抑菌环大小来判断其是否具有抑菌能力。本试验适用于抑菌剂与溶出性抗（抑）菌产品的鉴定。

抑菌环试验器材

(1)金黄色葡萄球菌 (ATCC 6538)、大肠杆菌(8099)、白色念珠菌 (ATCC 10231) 菌悬液及根据抑菌剂特定用途所用的其他菌悬液。

(2)抑菌剂载体 (5 mm 直径定性滤纸片，经压力蒸汽灭菌处理后，置 120℃烤干 2h，保存备用)。

(3)活菌培养计数所需器材。

(4)微量移液器(5μl～50μl，可调式)。

(5)游标卡尺。

(6)营养琼脂培养基、胰蛋白胨大豆琼脂培养基与沙堡琼脂培养基。

抑菌环试验操作程序

(1)抑菌片的制备:对液体抑菌剂，取无菌并干燥的滤纸片。每片滴加实际使用浓度抑菌剂溶液 20μl，然后将滤纸片平放于清洁的无菌平皿内，开盖置温箱(37℃) 中烤干，或置室温下自然干燥后备用。

溶出性抗（抑）菌产品，可直接制成直径为 5mm，厚不超过 4mm 圆片(块)，每 4 片(块) 一组。

(2)阴性对照样片的制备:取无菌干燥滤纸片，每片滴加无菌蒸馏水 20μl，干燥后备用。

溶出性抗（抑）菌产品的阴性对照样本，应取同种材质不含抑菌成份的样品，制成与试验组大小相同的样片(块)。

(3)试验菌的接种:用无菌棉拭子蘸取浓度为 5×105cfu/ml～5×106cfu/ml 试验菌悬液，在营养琼脂培养基平板表面均匀涂抹 3 次。每涂抹 1 次，平板应转动 60°，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好平皿，置室温干燥 5min。

(4)抑菌剂样片贴放:每次试验贴放 1 个染菌平板，每个平板贴放 4 片试验样片，1 片阴性对照样片，共 5 片。用无菌镊子取样片贴放于平板表面。各样片中心之间相距 25mm 以上，与平板的周缘相距 15mm 以上。贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面。盖好平皿，置 37℃温箱，培养 16h～18h 观察结果。用游标卡尺测量抑菌环的直径 (包括贴片) 并记录。试验重复 3 次。

测量抑菌环时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行。测量其直径应以抑菌环外沿为界。

抑菌环试验评价规定

(1)抑菌作用的判断:

抑菌环直径大于 7mm 者，判为有抑菌作用。

抑菌环直径小于或等于 7mm 者，判为无抑菌作用。

(2) 3 次重复试验均有抑菌作用结果者，判为合格。

(3)阴性对照组应无抑菌环产生。否则试验无效。

抑菌环试验注意事项

(1)每次试验均应设置阴性对照，不可省略。在报告中亦必须将对照组的结果列出。

(2)接种用细菌悬液的浓度应符合要求。浓度过低，接种菌量少，抑菌环常因之增大; 浓度过高，接种量过多，抑菌环则可减小。

(3)应保持琼脂浓度的准确性，否则可影响抑菌环的大小。

(4)培养时间不得超过 18h。培养过久，部分细菌可恢复生长，抑菌环变小。

(5)抑菌环直径可受抑菌剂的量、抑菌性能和干湿度影响。故抑菌剂滤纸片应在试验当天制备。