疫苗前沿 | 甲型流感病毒的反向疫苗学：从基因组测序到疫苗设计
疫苗前沿 | 甲型流感病毒的反向疫苗学：从基因组测序到疫苗设计
摘要：反向疫苗学(RV)利用生物信息学技术筛选特定病原体的全基因组序列，以鉴定可能引起最佳免疫反应的表位。计算机技术的使用大大减少了鉴定潜在疫苗所需的时间和成本，也简化了选择抗原的繁琐过程。RV方法已成功地应用于鉴定血清B群脑膜炎球菌(MenB)、炭疽芽孢杆菌、肺炎链球菌等新疫苗。作为研究案例，我们将深入探讨RV技术在甲型流感病毒上的应用。
1、介绍
自Rappuoli于2000年初提出该术语以来，“反向疫苗学”一词预示着这种创新方法将带来的大规模革命。这种方法基于基因组的信息，通过特定的生物信息学工具，能够用于确定最佳表位，以发现针对特定疾病的新的有效疫苗配方。传统的疫苗开发方法起源于18世纪早期，涉及使用减毒或灭活病毒，但是用这种技术生产的疫苗常常伴随着一些副作用。疫苗开发的两种传统方法都需要进行一系列的体外分析，鉴定潜在抗原的过程并不像看起来那么容易。不幸的是，大多数丰富的蛋白质通常不适合用于疫苗设计；另一方面，由于缺乏适当的遗传工具，鉴定不太常见的蛋白质可能非常困难。
过去20年生产的大多数疫苗都是基于现代重组DNA技术，然而，即使大多数亚单位疫苗已被证明是非常有效的，对于其中一些，它们似乎能够诱导的保护作用背后的机制仍然未知。迄今为止，一些技术进步已经能够加速疫苗发现和设计的早期步骤。RV研究是最早利用基因组测序产生的丰富信息进行疫苗开发的研究之一。使用RV方法开发的第一个临床批准的疫苗是针对脑膜炎球菌B群细菌感染的疫苗。RV技术的主要优点是鉴定出潜在的保护性抗原，而不需要在实验室培养病原体，无论纯化抗原的数量如何，这个结果转化为时间和资源方面带来巨大节省。
1.1. 反向疫苗学的方法概述
目前，有两种不同的算法可以用于定义RV方法的策略：决策树(过滤)或机器学习(分类)算法。下面将简要介绍这两种方法，并给出一些最适合这两种算法的工具的指导。
决策树(过滤):使用一系列过滤器在作为输入的蛋白质序列中识别潜在的候选疫苗。由于这个原因，这种方法需要使用类似流程图的程序来表示所应用的过滤器的顺序。使用这种方法的大部分研究没有共享任何标准方案，因此可能使用不同的生物信息学工具 ，通过创建新增强的反向疫苗学环境 完成了创建自动化RV工具的第一次尝试 。
机器学习(分类): 机器学习技术能够对整个细菌蛋白质组进行建模，并根据其引发保护作用的能力对预测的抗原进行分类 ，通过这种方式，成为潜在的候选疫苗。 VaxiJen3是应用机器学习RV时最常用的工具之一，也是第一个采用这种方法的RV软件。
RV技术是首次在美国应用，旨在鉴定一种新的有效的针对B群脑膜炎球菌(MenB) 的疫苗制剂。从它的第一次应用中，RV方法立即展示了它最大的优势。即使在传统方法未检测到的地方，它也可以发现可能的新表位，并且可以在更短的时间内产生结果，这一点至关重要，特别是在处理致命流行病时。
1.2. 个案研究：在针对甲型流感疫苗设计上RV方法的应用
反向疫苗学与计算建模相结合，有助于加快疫苗发现进程。这种联合方法最常见的应用之一是多表位疫苗的计算机辅助设计，这通常包括从数据收集到确定候选疫苗的几个阶段。然而，尽管这种方法在识别最佳抗原表位方面具有不可否认的作用，但它仍然存在一个主要缺陷: 无法证明疫苗制剂的治疗效果。
目前有一个解决方案来弥补这个不足，下面描述该解决方案：通用免疫系统模拟器(UISS)。
UISS是一种先进的基于主体的模型，可以忠实地再现人体免疫系统对精确刺激的反应。它使用多层方法，包括以下内容：
免疫系统对自我/非自我实体的生理反应(生理层)；
与疾病进展相关的动态(疾病层)；
针对该特定疾病的不同治疗方法所产生的效果(治疗层)。
这种多层次的组织结构使UISS特别灵活，易于适应多种生物场景，使其成为预测不同病理过程和任何新治疗效果的不可或缺的工具。作为一个有效的例子，我们专注于甲型流感病毒多表位疫苗的鉴定。
2、材料
2.1. 测序
从国家生物技术信息中心(NCBI)数据库已检索到HA和NA蛋白序列，在这个特殊的案例中，8种不同H5N1病毒的蛋白质序列已收集了1997年至2005年期间广泛传播的流感毒株。
2.2. 软件
本报告使用的所有软件已汇总在表1。
表1. 在建议的工作流程中使用的生物信息学工具
3、方法
3.1. 通用工作流
RV技术和UISS模拟器的结合使用创造了一个通用的工作流程（如图1所示），适用于识别针对任何病原体的最佳疫苗配方。
图1. 建议用于多表位疫苗设计的先进RV技术的工作流程
3.2. 甲型流感病毒蛋白序列的集合
甲型流感病毒是一种RNA病毒，其主要结构成分是血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白。甲型流感病毒具有进化的能力，产生几种不同的变种，甚至更具传染性和毒性，因此更难以对比。
应用工作流程鉴定潜在的抗甲型流感病毒多表位疫苗的第一步是从国家生物技术信息中心数据库收集的HA和NA蛋白序列。
3.3. 多序列比对
需要对选定的序列进行多序列比对(MSA)。MSA的目的是分析所有被调查序列之间的同源性和相关水平，以获得一致的序列，包括残基、氨基酸和核苷酸。
3.4. 表位预测
通过应用NetCTL 1.2预测细胞毒性t淋巴细胞(CTL)表位。辅助性t淋巴细胞表位也需要通过NetMHCIIpan 4.0 Server进行预测。B细胞表位的预测使用BepiPred Linear完成表位预测服务器。
3.5. 抗原性和变应原性评价
MHC-I、MHC-II和B细胞表位的预测已经完成，下一步是评估收集到的表位的抗原性和过敏原性水平，只鉴定那些既具有抗原性又不具有致敏性的抗原表位，并选择它们作为疫苗制剂的良好候选者。
3.6. 模拟UISS-FLU
作为最后一个基本步骤，使用了UISS平台中流感疾病层的具体实现。提高结果在免疫学变异方面的统计意义，建议所有的模拟都是使用100名具有不同免疫背景的虚拟患者进行的。
3.7. 结果
整个工作流程的最终结果是预测与以下免疫系统动力学相关的最佳疫苗配方：
肺上皮感染细胞和肺上皮细胞总数水平；
IgM, IgG和IgA浓度水平；
IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IFN-γ、TNF-α浓度水平；
中性粒细胞，MHC-II抗原呈递巨噬细胞，MHC-I抗原呈递树突状细胞和MHC-II抗原呈递树突状细胞的数量水平 ；
激活CD4 + Th1细胞，激活CD8 + T细胞，整体记忆B细胞和整体记忆Th1细胞群水平。
4、重点事项
ClustalOmega可以对齐多达4000个序列或最大文件大小为4 MB：对于较大的序列，需要对原始序列进行片段化，并逐个提交每个短序列；
NetCTL对提交数据的大小有几个限制： 每次提交最多5000个序列，每个序列应不超过20,000个氨基酸，不少于9个氨基酸，最多200,000个氨基酸；
BepiPred软件的新版本目前可用，解决了与第一个版本相关的大部分问题，该版本已在建议的工作流中使用；
UISS模拟器，用于评估所指示的疫苗制剂的有效性，并在被检查的疫苗中选择最佳表位，但可能会在某种程度上限制非专家的使用。 开发团队目前正在努力解决这个问题；
建议的多表位疫苗设计工作流程并不能提供完整的疫苗配方，简单地说，建议最佳的表位组合以获得最大的免疫反应。 这也影响到对疗效的评价，当然，这需要在疫苗开发的后期阶段进行测试；
用于设计多表位疫苗的方法没有提供任何关于最适当的给药途径的指示，这通常是直接的方法:注射到循环流中。
参考资料：Di Salvatore V, Russo G, Pappalardo F. Reverse Vaccinology for Influenza A Virus: From Genome Sequencing to Vaccine Design. Methods Mol Biol. 2023;2673:401-410. doi: 10.1007/978-1-0716-3239-0_27. PMID: 37258929.