内蒙古农业大学最新研究：不同泌乳期驼乳化学组成及蛋白质组学分析
内蒙古农业大学最新研究：不同泌乳期驼乳化学组成及蛋白质组学分析
双峰驼是中国西北戈壁荒漠地区特有的畜种，它们为当地居民提供乳、肉等优质蛋白质来源。驼乳具有高营养价值和多种健康功效，不含β-乳球蛋白，适合乳糖不耐受人群食用，且富含多种维生素和功能活性成分，具有抗炎、免疫调节等作用。泌乳期的阶段性变化是乳化学成分、理化性质等特征变化的一个重要影响因素，特别是对乳基础营养成分、理化性质及蛋白质组成影响显著。
内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室的明亮、李雅菲、伊丽等研究人员将骆驼整个泌乳期分为4 个阶段（泌乳初期（ELP）、泌乳中期（MLP）、泌乳后期（LLP）和干奶期（DLP）），分别收集驼乳样本，通过测定不同泌乳期驼乳基本营养组成和一般理化性质，阐明驼乳化学组成在整个泌乳期内的变化规律。进一步地，采用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）蛋白质组学技术检测骆驼初乳和常乳中的差异蛋白质，并结合生物信息学方法分析不同泌乳期驼乳差异蛋白质的功能，以期更好地解析驼乳蛋白质组成变化，为驼乳产品的开发提供理论参考。
不同泌乳期驼乳基础营养成分的变化
如表1所示，整个泌乳期内驼乳的基础营养成分有显著差异。ELP驼乳中蛋白质、脂肪、乳糖、非脂乳固体和总固形物含量最高（P＜0.05），而随着泌乳时间的延长，其含量迅速降低。在MLP驼乳中脂肪和蛋白质的质量分数显著降至3.46%和3.50%。与LLP驼乳相比，DLP驼乳中蛋白质含量具有显著上升趋势（P＜0.05），脂肪含量有所上升，但未达到显著水平（P＞0.05）。与ELP驼乳相比，常乳（MLP、LLP驼乳）和末乳（DLP驼乳）中蛋白质含量的急剧下降主要是与乳中免疫球蛋白浓度下降有关；此外，由于季节性放牧和环境温度的变化，在泌乳后期引起的骆驼自身营养摄入低和热应激状态导致了驼乳中脂肪含量的降低。
不同泌乳期驼乳理化性质的变化
如表2所示，ELP驼乳密度和折光率显著高于其他3 组（P＜0.05），分别是1.0403 g/cm3和1.3698。在整个泌乳期内，驼乳pH值和滴定酸度有显著变化（P＜0.05），ELP驼乳pH值为6.23，随后有缓慢上升趋势，直至DLP的pH值达到了6.89；ELP驼乳滴定酸度为19.98 °T，在MLP和LLP有所下降，然而在DLP显著上升至20.71 °T（P＜0.05）。ELP和DLP的驼乳属于异常乳，其乳中异常的盐类含量导致了初乳和末乳中较高或者较低的酸度值。乳电导率主要取决于乳中所含的电离子数量，泌乳期内驼乳的电导率相对较稳定，这与肖宇辰的研究类似。研究表明，骆驼常乳密度为1.028～1.040 g/cm3，pH值为6.31～6.57，滴定酸度为18.67～21.69 °T，与本研究的实验结果相存在一定的差异，主要与骆驼的品种、泌乳阶段、环境、饲养管理等多种因素有关。
驼乳蛋白质质谱鉴定与主成分分析
对骆驼初乳和常乳中的蛋白质进行质谱分析，共检测到了176121 个二级质谱图，并利用Mascot查库共鉴定到3903 个肽段、4467 个蛋白质和1077 个蛋白质group（图1A）。鉴定到的蛋白质分子质量主要分布在1～100 kDa（85.23%），其中位于20～40 kDa之间的蛋白质最多，占鉴定到的蛋白质总数的31.01%；其次是40～60 kDa之间的蛋白质，占鉴定到的蛋白质总数的22.84%（图1B）。鉴定到的蛋白所含肽段的数量分布统计结果显示，82.36%的蛋白质分别由1～5 个肽段组成（图1C），且已鉴定的蛋白质序列覆盖率相对较低，97%的蛋白质的覆盖率低于40%（图1D）。
主成分分析的结果显示，各组蛋白质谱在主成分1和主成分2方向上存在明显的分离趋势，总贡献率达到了83.60%（图2），表明骆驼初乳和常乳蛋白质谱有明显的变化，且差异显著。
驼乳差异蛋白质分析
相比牛乳、马乳和驴乳，在骆驼乳中发现了独有的特征性蛋白，如乳清酸性蛋白（WAP）（登录号：P09837），其在骆驼常乳中的表达量更高一些（FC（常乳/初乳）＝1.35）。WAP是一种蛋白酶抑制剂，参与乳腺的终末分化，具有抗菌活性；初次在小鼠的乳汁中被发现，此后在兔子、猪、骆驼、小袋鼠、负鼠等缺少β-Lg的哺乳动物乳中陆续被发现。此外，在骆驼乳中发现了高峰度的免疫球蛋白、类胰岛素、乳铁蛋白等保护性蛋白，包括IgG受体Fc（登录号：Q2KN22）、Igλ链V-I区（登录号：S9YD96）、Igλ链V-II区（登录号：S9XR91）、Igλ链V区（登录号：S9WRJ0）、Igλ链V-III区（登录号：S9XR89）、IgG轻链（登录号：A0A8B8SBE3）、Igκ链V-II区（登录号：S9X3E8）、Igμ链C区（登录号：A0A5N4E3Y8）、胰岛素样生长因子蛋白2（登录号：A0A8B8T2A6）、胰岛素样生长因子蛋白3（登录号：A0A8B8SPV4）和胰岛素样生长因子蛋白5（登录号：A0A8B8T1T1），这与Bakry和Zou Zhengzheng等关于驼乳中蛋白质组成的研究结果一致。Zou Zhengzheng等在不同季节（春、夏、秋、冬）的驼乳中鉴定到了乳铁蛋白、肽聚糖识别蛋白1、骨桥蛋白、乳过氧化物酶、Ig3等功能蛋白，而未检测到胰岛素生长因子相关的蛋白，其主要原因是该功能蛋白在常乳中的含量较低，因此在蛋白质图谱中未检测到该蛋白。
研究表明，母体分娩24 h后，新生幼崽能将乳中的免疫球蛋白直接吸收至体内，成为免疫系统的一部分，因此，驼乳中高浓度的免疫球蛋白有助于驼羔免疫系统的完善，进而抵抗外环境病毒和细菌的感染。胰岛素样生长因子可以刺激和调节身体组织的生长和发育，维持身体组成，并调节营养代谢；驼乳中高浓度的胰岛素样生长因子可有效调节驼羔体内营养代谢，促进驼羔健康快速生长。此外，不同于牛乳、驴乳和羊乳中的蛋白质，驼乳的蛋白质谱与人乳相似，不含β-Lg，富含高峰度的α-乳白蛋白和乳铁蛋白，且含有少量的κ-酪蛋白。
如图3所示，对鉴定到的蛋白进行差异分析，在骆驼初乳和常乳中共鉴定到641 个差异蛋白（P＜0.05）；与骆驼常乳相比，骆驼初乳中存在414 个表达显著上调的蛋白质和227 个显著下调的蛋白质。
在不同泌乳期的差异蛋白质中，催乳素诱导蛋白（登录号：AOA5N4DYK7）、Sushi结构域蛋白（登录号：A0A5N4C9M0）、Ras相关蛋白（登录号：A0A8B6YBW7）、突触囊泡糖蛋白（登录号：S9Y6C4）在骆驼常乳中均表现出高表达水平（骆驼常乳蛋白表达量均大于骆驼初乳蛋白的4 倍以上）；其中催乳素诱导蛋白可促进乳腺发育生长，刺激并维持泌乳；突触囊泡糖蛋白与递质释放关系密切。以上常乳中高峰度的蛋白质可促进骆驼的产乳量，致使从初乳到常乳骆驼产奶量提高的可能的原因之一。血管生成素相关蛋白（登录号：A0A8B6YFQ4）、肿瘤坏死因子诱导基因6蛋白（登录号：A0A5N4E6V3）、血小板反应蛋白-1（登录号：A0A5N4E0K1）、IgG受体FcRn大亚基p51（登录号：Q2KN22）、骨桥蛋白（登录号：A0A5N4EIH9）、金属蛋白酶抑制剂（登录号：S9X831）在骆驼初乳中高表达（骆驼初乳蛋白表达量均超过骆驼常乳蛋白的5 倍以上），以上差异蛋白质具有促进炎症吸收、促进伤口愈合、抗炎、组织保护与修复的作用，并在免疫系统中具有重要的趋化作用，为免疫系统尚不完善的新生驼羔抵御外界病原微生物提供了保障，同时保证母畜的乳腺健康，减少罹患乳腺炎的机会。邓微等基于iTRAQ技术分析牛初乳与常乳差异蛋白质，表明牛初乳中高表达量蛋白主要是与免疫相关的蛋白，这与本研究结果一致。
驼乳差异蛋白质功能富集分析
对骆驼初乳和常乳差异蛋白质进行GO功能注释分析可知，骆驼乳中蛋白质参与的生物过程以细胞过程、生物调节、代谢过程、定位生物学过程最为丰富，此外，对刺激的反应和细胞发育过程也占很大比例（图4）。骆驼乳蛋白质的主要细胞组分包括细胞结构实体和含蛋白质复合物。结合、催化活性、分子功能调节、结构分子活性、分子转化活性是骆驼乳蛋白的主要分子功能。目前，其他畜乳差异蛋白质功能富集分析表明，人乳、驴乳和牛乳中主要的差异蛋白质富集在生物调控、免疫应答、信号转导等信号通路中，与本研究的结果相似。与骆驼常乳相比，骆驼初乳中上调的蛋白质主要富集在免疫反应的激活、生物过程调控、代谢过程、离子结合、蛋白质装配、刺激反应等，可有效促进幼龄驼羔的健康发育，保持机体正常生长。可见骆驼初乳蛋白不仅为新生幼崽提供良好的营养来源而且是新生驼羔免疫系统的重要组成部分，对于感染性疾病有良好的预防和缓解作用。
骆驼初乳和常乳差异蛋白质的KEGG通路分析
如图5所示，以P＜0.05作为显著性富集的条件，骆驼初乳和常乳差异蛋白质中KEGG显著性富集的代谢通路有20 个，主要有金黄色葡萄球菌感染、维生素的消化和吸收、自身免疫性甲状腺疾病、脂肪的消化和吸收、单纯疱疹病毒1型感染等，以上代谢通路的差异对两个泌乳期驼乳的功能差异有很大的影响。研究表明，牛乳中差异蛋白质主要在抗菌、抗炎、抗病毒以及疾病相关途径中发挥关键功能；而驴乳中的差异蛋白质与本研究驼乳中功能蛋白质的富集通路相似，主要与免疫、溶菌酶、补体和凝血级联信号通路等相关。
补体和凝血级联通路是骆驼初乳和常乳差异蛋白质主要参与的通路，共检测到63 个差异蛋白质富集在此通路中。研究发现，补体是一种由补体蛋白、调节蛋白和受体等多种蛋白组成的体液免疫系统，通过一系列复杂的反应，可引起溶菌作用、吞噬作用、趋化作用和天然免疫的杀菌作用等，对机体健康至关重要。检测到的差异蛋白质在初乳中高表达，进而有效的调控下游生物效应的发挥，如初乳中高表达的补体系统枢纽，可影响下游补体片断3b调控病原体及吞噬功能，进而维持体内免疫健康。此外，转化生长因子-β信号通路可调节并维持组织内环境平衡，参与细胞生长、分化、凋亡、运动和侵袭；过氧化物酶体增殖激活受体信号通路在炎症、动脉粥样硬化、胰岛素抵抗和糖代谢调节等方面均有着举足轻重的作用。因此，这些高表达的驼乳蛋白质对营养代谢以及驼乳品质的形成具有非常重要的作用。
结论
本研究测定了不同泌乳期驼乳理化性质，分析了整个泌乳期驼乳理化性质的变化规律。进一步，采用iTRAQ蛋白质组学先进技术对骆驼初乳和常乳蛋白质的组成及丰度差异进行了鉴定与筛选。泌乳期对驼乳蛋白质、脂肪、乳糖、总固形物、非脂乳固体含量的影响较大，而对其物理性质（密度、pH值、滴定酸度、折光率和电导率）的影响较低。在4467 种鉴定的具有定量信息的驼乳蛋白质中，发现了641 个差异显著蛋白质（P＜0.05）。骆驼初乳和常乳中蛋白质谱在主成分1、2的方向上存在明显的分离趋势；且与骆驼常乳相比，骆驼初乳中存在414 种丰度上调表达蛋白，227 种丰度下调表达蛋白，说明骆驼初乳与常乳在蛋白质丰度上存在较大差异。通过差异蛋白质的筛选、GO功能注释、KEGG通路分析发现，骆驼乳中筛选到了高峰度的免疫球蛋白、类胰岛素、乳铁蛋白等保护性蛋白；在骆驼初乳和常乳中差异的高丰度蛋白主要与免疫应答、抗炎、组织保护与修复、代谢过程有关，并主要富集在金黄色葡萄球菌感染、维生素的消化和吸收、自身免疫性甲状腺疾病、脂肪的消化和吸收等相关通路中。本研究对不同泌乳期驼乳理化性质以及骆驼初乳和常乳蛋白质丰度的差异进行了深入研究，找到了重要的功能性蛋白质，这些蛋白质的发现能够为日后生产及优化功能性乳制品提供理论依据。
本文《不同泌乳期驼乳化学组成及蛋白质组学》来源于《食品科学》2024年45卷第12期205-211，作者：明 亮，李雅菲，吕浩迪，浩斯毕力格，伊 丽*。DOI：10.7506/spkx1002-6630-20231007-029。