质粒的概念、用途以及纯化全解析

质粒的概念、用途以及纯化全解析

早在19世纪40年代，科学家们就发现了一种可以在细胞之间互相转移的细胞质遗传因子，并提出了多种猜测，包括寄生虫、共生体、基因等。但命名始终未得到最终的确认。直到1952年，Joshua Lederberg开始着手阐明这些细胞质遗传因子的分类，并首次提出了"Plasmid"这个名称。"Plasmid"是"Cytoplasm"和"id"（拉丁语中的"it"）的整合体，并将其作为"任何染色体外遗传决定因子"的通用术语。

图1. 质粒

质粒是小的环状超螺旋双链DNA，在宿主细胞内独立于染色体外自主复制并稳定遗传，可通过基因工程改造接入外源DNA作为基因载体，转入宿主细胞。如今，质粒已成为生物制药领域中最重要的工具之一，可用于克隆、扩增和表达目的蛋白；也可用于病毒载体和mRNA的生产等领域。

质粒有多种拓扑结构，包括超螺旋质粒、开环质粒、线性质粒，其中超螺旋质粒被认为是活性最高的组分，而开环质粒由于转导细胞效率较低，需要在质粒成品中严格控制其含量。

质粒生产流程

图2. 质粒生产流程

质粒生产工艺目标

• 获得一定规模的高纯度超螺旋DNA（ssDNA）
• 去除产品相关杂质：开环DNA（ocDNA），质粒DNA聚集体（dimer，trimer，tetramer，etc.）
• 去除工艺相关杂质：HCP，HC-DNA，HC-RNA
• 控制生物负荷：内毒素，微生物
• 工艺流程稳健，可重复性好
• 可进行线性放大

质粒纯化工艺

1. Bestarose 6FF 层析

• 样品准备：中空纤维浓缩后样品
• 6FF层析目的在于快速去除大量RNA，收率一般在90%以上
• Buffer：2.1M(NH₄)₂SO₄-10mM EDTA-100mM Tris, pH7.5
• 柱高可选择30~50cm
• 进样量控制在15~25% CV
• 操作流速60~120cm/h
• 收集到的流穿，超螺旋比例基本在80%左右

图3. 凝胶过滤图谱

2. Plasmid 亲和层析

• 高效分离超螺旋质粒（scDNA）和开环质粒（ocDNA），去除开环DNA，收率一般大于80%，经过该步纯化后，超螺旋比例在95%左右。
• Buffer A：2.1M(NH₄)₂SO₄-10mM EDTA 100mM Tris, pH7.5
• Buffer B：1.7M(NH₄)₂SO₄-0.3M NaCl-10mM EDTA-100mM Tris, pH7.5
• 碱洗：0.5M NaOH 23CV，静置1530min
• 水洗：2~3CV
• 平衡：BufferA 2~3CV，至pH、Cond平衡
• 上样：不超过2.5mg/mL，保留时间不低于3min
• 清洗：Buffer A清洗3~5CV
• 洗脱：Buffer B洗脱

图4. 亲和层析图谱

3. Q Mustang 阴离子交换层析

• 利用高分辨率去除残留内毒素及痕量杂质，收率一般可达80%。
• Buffer A：0.4M NaCl-10mM EDTA-100mM Tris, pH7.5
• Buffer B：1.0M NaCl-10mM EDTA-100mM Tris, pH7.5
• 样品：亲和洗脱液与TE Buffer进行1:2稀释
• 层析过程：
• 碱洗：0.5M NaOH 23CV，静置1530min
• 水洗：2~3CV
• 平衡：Buffer A 2~3CV，至pH、Cond平衡
• 上样：不超过2mg/mL，保留时间不低于3min
• 清洗：Buffer A清洗3~5CV
• 洗脱：Buffer B洗脱

图5. 阴离子交换层析图谱

实验结果分析

为方便质粒纯化后实验结果分析，博格隆推出Ezscreen Bestarose 6HP预装柱，用于质粒定量分析。

图6. 质粒分析图谱