WB蛋白定量详解：BCA法与Bradford法的原理、操作及应用

WB蛋白定量详解：BCA法与Bradford法的原理、操作及应用

Western Blot（WB）实验是生物医学研究中常用的蛋白质检测技术，而蛋白定量是确保实验结果准确性的关键步骤。本文将详细介绍WB蛋白定量的重要性和具体方法，特别是BCA法和Bradford法的原理、优缺点及操作步骤。

为什么要进行蛋白定量？

WB实验需要对样品总蛋白进行定量，主要目的是对样品进行均一化处理，也就是使各个泳道蛋白总上样量一致。特别提醒这里的总上样量一致，是以质量单位上样（μg/孔）而不是以体积单位上样（μl/孔）。

举例说明

• 目的蛋白表达量差异性：下图显示了目的蛋白表现出的表达量差异性。
• 内参表达量不均一：再看一下内参的表达量，可以看出上样量不均一，导致样品间表达水平差异没有意义。
• 内参均一性良好：下图中内参均一性非常好，这样才能说明目的蛋白的差异是有意义的。
• 上样量优化：另外还可以根据定量结果，优化上样总量，以得到更佳的结果。下图显示了上样量太大导致的过曝反白现象。

蛋白定量有哪些方法？

蛋白质种类很多，结构、功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量的方法带来了许多困难。目前依据不同的原理，已经出现多种蛋白定量的方法。总蛋白定量的方法主要有Bradford法，BCA法，紫外分光光度法，lowry法等。今天主要讨论Bradford法和BCA法。

Bradford法 和 BCA法对比

BCA法和Bradford法注意事项

• 因为显色反应与温度和时间的变化有关，为了尽可能准确测定未知样品中的总蛋白浓度，建议每次进行分析时都应制作标准曲线。
• 超出标曲范围内的数值无法确定，务必保证样品数据在标准曲线范围内。
• 为了减小误差，建议做3个复孔。

如何选择定量的方法？

要根据样品的组份，定量的区间，反应的时间，仪器设备等综合判断分析，选择最合适的方法。主要看样品中去垢剂，如果你的蛋白抽提试剂含有大量去垢剂，请选择BCA法。如果你的样品中含有EDTA等金属螯合剂(BCA法中Cu离子被螯合走)，或者含有还原性，建议选择Bradford法。

操作步骤

1. 计算并配置工作液；
2. 加入即用型标准品或梯度稀释的标准品，以及待测样品；
3. 加入BCA工作液。37℃孵育30min；
4. 测A562nm吸光值；
5. 制作标准曲线，并计算样品浓度。

绘制标准曲线 计算样品浓度

1. 观察测得OD值的每个复孔数值，是否有偏移较大的，如果有，去除该数值，或者去除这个检测点。
2. 计算平均值：计算各个浓度标准品以及样品OD值的平均值。
3. 输入标准品的对应的浓度，选中标准品OD值和标准品浓度，插入散点图。
4. 弹出一个图表，右击图表里面的散点，选择添加趋势曲线。
5. 右击趋势线，选择趋势线格式，选勾显示公式（E）以及显示R平方值。则在图表标题中显示出公式和R2值来。一般R2值越接近1代表你的标准曲线做得越好，根据标准曲线带入的样品OD值测出的蛋白浓度也越准确。R2值一般要求大于等于0.99。
   
6. 计算样品浓度。将样品OD值代入标准曲线的公式中，推导即得到待测样品蛋白的浓度。如果检测样品是稀释后的样品，则实际浓度需要乘以对应的稀释倍数。注意：公式中X,Y分别代表是什么，以及浓度的单位！

常见问题解答

1. 是否可以通过细胞计数代替蛋白定量？
   至少预实验的时候建议做蛋白定量。虽然蛋白定量主要目的是对样品进行均一化处理，保证上样量一致。但是另一个作用优化上样量，也十分重要。上样量太低，目标蛋白可能检测不到；上样量太高有可能导致过曝，灰度值分析误差大。有文献报道总蛋白上样量超过10ug/孔时内参蛋白不够敏感，无法检测到差异。内参蛋白理想的上样量5ug以内，目标蛋白的上样量为10-20ug。

2. 定量后，内参还是不齐怎么办？
   首先，蛋白定量环节：注意样品中是否含有干扰物质，选择适合的定量方法；检测的值是否在线性范围内；做复孔，减小误差。
   其次，转膜环节：注意转膜的均一。
   最后，注意内参蛋白的选择是否合适。比如GAPDH是常用的内参蛋白，但是GAPDH是糖酵解过程中的一个酶，在缺氧，糖酵解紊乱等情况会增加GAPDH在特定细胞中的表达。内参蛋白要选表达不受实验处理影响的蛋白。现在也有很多人用总蛋白作为内参，即通过考马斯亮蓝或者丽春红染总蛋白，伯乐推出stain-free免染胶，也可以准确反应每个泳道中的蛋白量，可以作为WB的可靠内参。

3. 样品间浓度差异大，如何调节浓度？
   样品提取时，组织样品可以通过称量，细胞样品可以通过计数，等比例加入提取液。这样各组样品浓度差异就不会非常大了。