张兴栋院士团队揭秘：标签序列对重组人源化胶原蛋白结构和功能的影响
张兴栋院士团队揭秘：标签序列对重组人源化胶原蛋白结构和功能的影响
在生物医学的广阔天地里，重组胶原蛋白一直是科研者们热衷探索的领域。近期，中国工程院院士、锦波生物首席科学家张兴栋领衔的团队在《Regen Biomater》杂志上发表了重大研究发现：标签序列的引入会影响重组人源化Ⅲ型胶原蛋白（rhCol Ⅲ）的高级结构和性质，从而影响rhCol Ⅲ调控雪旺细胞（SCs）的粘附、扩散、迁移和增殖的能力。
对于天然胶原蛋白来说，一级结构可以被认为是胶原功能多样性的基础，而包括二级和三级结构在内的高级结构，即三螺旋结构是细胞-物质相互作用的决定因素。对于重组胶原蛋白，二级或三级结构对多肽的稳定性和功能至关重要。
为了解人工引入的标签序列对rhColⅢ高级结构的影响，研究团队精心设计了两个具有不同氨基酸序列的代表性标签，并将其添加到rhCol Ⅲ重复单元的N端，即rhCol Ⅲ标签（H10C30，T10C30）。通过一系列严谨的实验，他们得出了以下重要发现：
标签序列对rhCol Ⅲ高级结构的影响
（图示：rhCol Ⅲ标签的3D结构和结合位点与rhCol Ⅲ不同。（A） Alphafold2预测的rhCol Ⅲ和rhCol Ⅲ标签（H10C30和T10C30）的3D结构。（B）预测的ZDOCK最高的分子自对接模型。黄线：氢键。）
如图A和B显示，通过AF2对rhCol III和rhCol III-tag (H10C30, T10C30)的高级结构进行预测，并通过分子对接实验模拟链-链间结合方式，发现在N端引入额外的氨基酸序列可导致蛋白质折叠的构象变化，同时，肽链间氢键的分布和数目也明显不同。
结果表明，标签序列的加入会改变rhCol Ⅲ的空间构象，进一步生成的氢键会稳定多肽链的高级结构，这与没有标签序列的rhCol Ⅲ有显著差异。
（图示：rhCol Ⅲ和标签rhCol Ⅲ的CD光谱）
CD光谱中220 nm附近的正峰是具有三螺旋结构的天然胶原蛋白的主要特征之一，该特征峰的消失或明显移位可以认为三螺旋结构未保留或胶原变性。实验发现，在rhCol Ⅲ标签的CD谱图中没有发现明显的峰，表明缺乏蛋白质先进的结构。
因此推断，在rhCol Ⅲ上引入标签序列将导致多肽链的先进结构显着不同。
标签序列对rhCol Ⅲ生物活性的影响
研究团队通过评估SCs的细胞粘附、迁移和增殖等行为，以了解标签序列对rhCol Ⅲ生物活性的影响。
（图示：rhCol Ⅲ和标签rhCol Ⅲ对SCs粘附、扩散、迁移和增殖的影响比较。（A）SC孵育后1小时的细胞粘附测定。（B 和 C） 划痕测试和定量分析的图像。比例尺 = 100 μm。（C） 24 小时和 48 小时的细胞增殖测定。*P < 0.05，**P < 0.01，****P < 0.0001。）
图A显示，0.1 mg/ml rhCol Ⅲ组的OD值显著高于空白对照组和rhCol Ⅲ标签组，而后两者差异不显著。表明rhCol Ⅲ有利于SCs的粘附，但标签序列的引入会淬灭细胞-rhCol Ⅲ相互作用以降低细胞粘附。
图 B 和 C显示，共培养24 h后，rhCol Ⅲ组的细胞迁移率显著增强，而对照组和rhCol Ⅲ标签组的差异在所有时间间隔内均不显著。
图D（细胞增殖结果）进一步验证了rhCol Ⅲ的积极作用以及标签序列对相应性能的影响。
因此，rhCol Ⅲ上的标签序列不仅改变了先进的结构，还影响了与细胞的相互作用，这可能是仿生生物材料最重要的特征。
不同浓度rhCol Ⅲ对SCs行为的影响
研究团队采用梯度浓度的rhCol Ⅲ溶液进一步探究rhCol Ⅲ对SCs行为的影响，包括细胞粘附、扩散、迁移和增殖。
（图示：rhCol Ⅲ 改善了 SC 的粘附、扩散、迁移和增殖。（A）SC孵育后1小时的细胞粘附测定。（B） SCs孵育后4小时免疫荧光染色和SCs孵育后24小时细胞骨架染色。红色：vinculin。紫色：p-paxillin。绿色：鬼笔环肽。蓝色：DAPI。比例尺 = 15 μm。（C 和 D） 划痕测试和定量分析的图像。比例尺 = 100 μm。（E） 24 小时和 48 小时的细胞增殖测定。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。）
图A显示，所有rhCol Ⅲ组的SCs粘附率均显著高于对照组，其中0.1 mg/ml组的OD值最高。
图B表明rhCol Ⅲ促进SCs在早期细胞粘附期（前4小时）扩散。此外，当与0.1 mg/ml rhCol Ⅲ共培养24小时时，观察到更多更长的SC丝状伪足。
图C和D显示，0.05、0.1和0.5 mg/ml rhCol Ⅲ组的SCs迁移率在暴露后24、36和48 h时明显高于对照组，而0.5 mg/ml的迁移率最为明显。
图E表明，处理后24 h，rhCol Ⅲ组的OD 450值（0.01、0.05、0.1、0.5 mg/ml）高于对照组（P<0.05），说明rhCol Ⅲ可促进SCs增殖。处理后48 h，rhCol Ⅲ组（0.01、0.05和0.1 mg/ml）与对照组细胞增殖差异显著增加。此外，在24 h和48 h时，0.1 mg/ml组的吸光度值均高于其他组，表明0.1 mg/ml rhCol Ⅲ可能是当前培养条件下促进SCs增殖的最合适浓度。
以上实验的结果证明6个氨基酸的标签序列就可以在结构上影响胶原蛋白的三螺旋形成，从而影响蛋白质的功能活性。这一重大发现不仅具有深远的理论意义，还为生物材料的创新设计和实际应用指明了新的方向。