分子生物学方法学介绍|蛋白纯化常用方法

分子生物学方法学介绍|蛋白纯化常用方法

蛋白纯化是生物研究中非常重要的一个步骤。在生物样品中，目的蛋白通常和其他多种蛋白质和杂质混杂在一起，纯化能够去除非目标成分，高纯度的蛋白对于研究其结构和功能十分关键。蛋白纯化通常是利用不同蛋白在物理、化学、生物学等性质上的差异将目的蛋白从样品中分离出来，本文就来介绍几种常用的蛋白纯化方法。

凝胶过滤层析

是一种基于分子本身大小进行分离的方法。惰性凝胶介质是由物理化学性质稳定的球形微珠组成的多孔基质，小分子很容易进入微珠，因此流速较慢；大分子则不能进入微珠，因而会快速流过柱子；中等大小的分子会选择性地进入孔径大小合适的微珠，迁移率居中。因此，大分子首先从柱中流出，小分子最后流出。适用于分离纯化蛋白质（包括酶类）、核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等物质。

优点：操作方便、重复性好、样品回收率高。

缺点：分辨率不高，对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离；不适用于分离粘度较高的样品。

图1 凝胶过滤层析示意图

离子交换层析

是一种依据蛋白表面所带电荷量不同进行蛋白分离纯化的技术。蛋白表面通常会带有一定的电荷，电荷的氨基酸残基均匀地分布在蛋白质的表面，在一定条件下可以与阳离子交换柱或阴离子交换柱结合。这种带电分子与固定相之间的结合作用是可逆的，在改变pH或者用逐渐增加离子强度的缓冲液洗脱时，离子交换剂上结合的物质可与洗脱液中的离子发生交换而被洗脱到溶液中。由于不同物质的电荷不同，其与离子交换剂的结合能力也不同，所以被洗脱到溶液中的顺序也不同，从而达到分离的效果。

优点：分离效率高、灵敏度高、样品回收率高。

缺点：实验需要使用大量缓冲液和洗脱液；不同性质的样品需要不同的离子交换剂和分离条件。

图2 离子交换层析示意图

亲和层析

是一种通过分子间的特异性识别和相互作用来分离纯化物质的层析方法。目的分子与偶联有亲和试剂的层析柱结合，而所有或绝大多数其他分子因不能与之结合而流出柱子，然后用干扰这种特异性结合的溶液将目的分子从柱上洗脱下来。亲和层析技术可以利用配基（在亲和层析中起可逆结合的特异性物质）与生物之间的特异性吸附来分离蛋白，也可以在蛋白上加入标签，利用标签与配基的特异性结合来纯化蛋白。

优点：特异性强、分离效率高、可用于纯化含量少且不稳定的活性生物分子。

缺点：成本较高；样品中的其他蛋白可能会破坏配基或发生非特异性结合。

图3 亲和层析示意图

不同层析方法特点对比

表1是小编整理的不同层析方法特点。亲和层析特异性最高，是目前最常用的蛋白纯化方法。蛋白纯化通常会在目的蛋白的C端或N端加上标签蛋白，如Flag、His、GST等，其中His标签非常小对目的蛋白本身特性几乎没有影响且免疫原性较低是蛋白纯化的首选标签。下期将详细介绍His-tag融合蛋白使用镍柱亲和层析的实验操作和注意事项，感兴趣的小伙伴可以留意一下哦~

表1不同层析方法特点