【经典实验】手把手教你TUNEL法检测细胞凋亡

【经典实验】手把手教你TUNEL法检测细胞凋亡

引用

丁香园

1.

https://3g.dxy.cn/bbs/topic/46387333

细胞凋亡是细胞生物学研究中的一个重要领域，准确检测细胞凋亡对于理解细胞死亡机制、疾病发生发展以及药物筛选等具有重要意义。TUNEL法（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法）是目前最常用的细胞凋亡检测方法之一，其原理是通过标记细胞凋亡过程中产生的DNA断裂末端来检测凋亡细胞。本文将详细介绍TUNEL法检测细胞凋亡的具体实验步骤和注意事项。

实验原理

细胞在发生凋亡时会激活一些DNA内切酶，这些内切酶可以使染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可通过荧光显微镜或者流式细胞仪对凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。

在正常细胞或正在增殖的细胞中几乎不发生DNA的断裂，也就没有3'-OH的形成，TUNEL检测后很少能够被染色，这就是利用TUNEL法检测细胞凋亡的原理。

实验步骤

本次以贴壁细胞爬片为检测对象，阐述TUNEL法检测细胞凋亡的步骤：

1. PBS洗涤1次细胞爬片；
2. 用4%多聚甲醛固定细胞30-60 min；
3. 用PBS洗涤1次；
4. 加入含0.1% Trition X-100的PBS，冰浴孵育2 min；
5. 用PBS洗涤2次；
6. 滴加50μL TUNEL检测液，37ºC避光孵育60 min（孵育时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润，以尽量减少TUNEL检测液的蒸发）；
7. PBS洗涤3次；
8. 用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。

实验结果

图1. TUNEL染色结果

图2. DAPI染色结果

实验注意事项

1. 实验操作过程中注意避光；
2. 实验过程中所用试剂要现用现配。