北中医中药复方配伍研究：揭秘中医复方“君-臣-佐-使”配伍理论
北中医中药复方配伍研究：揭秘中医复方“君-臣-佐-使”配伍理论
在中医临床实践的悠久历史中，积累了相当数量的在体内既有效又安全的中药方剂，这些方剂是根据“君”（皇帝）-“臣”（大臣）-“佐”（助手）-“使”（信使）的中医理论配制的：
- “君”或君臣的草药完成了治疗的主要任务，包括中和疾病的主要症状；
- “臣”的草药则支持“君”的作用，旨在加强由“君”的作用引发的防御机制；
- “佐”，即辅佐的草药，它既可以治疗“君”或“臣”带来的侧害，也可以针对从属疾病或抵消君主草药的生理机制，必要时表现出相反的作用；
- “使”，它从字面上起着引导其他分子的作用，特别是当它到达已知疾病来源的特定组织或器官时。此外，“使”可以帮助协调配方中的药物以消除病原体。
从以上中药配伍的规律中，我们可以看出，中药复方远不止简单的加和，每一味药材都在其中发挥自己的作用，而这也同样说明，配伍后复方中的成分远比单独每一味药材来的复杂，接下来，我们一起来重点看于2024年2月发表在AdvancedScience上面的一篇中药复方对于缓解部分癌症治疗带来的不良反应的研究内容，这篇研究也非常有意思的关注到了复方配伍后形成的N-QY305纳米小颗粒对调节皮肤和结肠组织中CXCL2的表达从而缓解由于癌症治疗带来的皮肤和腹泻两个不良反应。
技术路线
研究背景
在癌症靶向治疗中，表皮生长因子受体抑制剂（epidermalgrowth factor receptor inhibitors,EGFRIs）被广泛应用于临床治疗含有EGFR激活突变的癌症患者，尤其是非小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌等。随着EGFRIs的应用，一些患者出现了多种不良反应，其中皮肤不良反应（包括皮疹、干燥、瘙痒、甲沟炎等）和腹泻是最常见的不良反应。在癌症治疗过程中，严重的皮肤不良反应和腹泻可能会暂时终止抗癌治疗同时极大地影响患者的生活质量。这些不良反应对癌症治疗和无进展生存非常不利。因此预防和适当管理已知毒性与有益的药物可以非常有效地支持整个癌症治疗过程。然而，指南推荐用于皮肤不良反应的润肤剂或抗生素（如米诺环素），用于腹泻的口服补液盐或阿片受体激动剂（如洛哌丁胺），并没有带来令人满意的结果。因此，迫切需要开发新的治疗方法来减轻EGFRIs治疗的皮肤不良反应和腹泻。
以中药为基础的治疗提供了使用多组分药物和作用于多靶点的可能性，可用于世界各地的临床试验。同样，本研究的重点是一种中药配方T-QY305，也被称为气阴三良散汤，在临床上广泛应用于皮肤和胃肠道疾病。T-QY305由五种药材组成：黄芪30g，金银花30g，当归30g，甘草10g，蜈蚣1g。之前初步研究在临床和动物实验中发现T-QY305可以改善EGFRIs诱导的皮肤不良反应和腹泻。然而，T-QY305减少EGFRIs引起的皮肤不良反应和腹泻的药效学基础尚不清楚。
纳米技术的兴起使其参与到许多研究领域，其中被广泛应用于诊断、成像、药物输送和其他生物医学领域，这些领域与中医密切相关，甚至朝着融合的方向发展。事实上，自组装纳米结构已被报道存在于某些中药方剂中，并被证明具有增强生物功能的作用，这一特征继承自基于中医“君”—“臣”—“佐”—“使”理论的中药方剂。因此，本研究基于NQY305是减少EGFRIs不良反应的关键因子的假设，对N-QY305的治疗效果和作用机制进行了研究。
研究结果
1.T-QY305对EGFRIs致皮肤不良反应的临床观察
据报道，EGFRIs具有显著的抗癌作用。然而在抗癌药物成功发挥作用之后，也同时在一些患者中观察到的不良反应。为评价T-QY305对EGFRIs诱导肿瘤患者皮肤不良反应的疗效，首先进行了临床观察。收集4例肿瘤患者信息，给予靶向治疗（主要为EGFRIs），几周后出现皮肤不良反应，接受T-QY305治疗。本研究收集的数据仅涉及两名患者，其中一男66岁，另一女60岁，均有皮肤不良反应，给予T-QY305治疗，每天口服2次，连用14天。研究显示，经T-QY305治疗后，两例患者的皮疹、干燥、瘙痒症状均有不同程度的缓解（图1b、c）。重要的是，未发现其他与T-QY305相关的不良反应。实际上，它可以减少一些病人的腹泻；然而由于某些原因，临床数据无法监测。
图1.T-QY305对EGFRIs致皮肤不良反应的临床研究
2.T-QY305减轻Gefitinib对荷瘤balb/c裸鼠皮肤不良反应及腹泻的影响抗菌治疗诱导的人宿主蛋白变化
EGFRIs与皮肤不良反应和腹泻等不良反应有关，为了更好地研究EGFRIs引起的皮肤不良反应和腹泻的临床过程，进一步研究T-QY305的作用，构建balb/c裸鼠原位非小细胞肺癌模型和皮肤不良反应和腹泻同时发生的模型。接下来测试了不同剂量T-QY305或阳性药物对Gefitinib诱导的balb/c荷瘤裸鼠皮肤不良反应和腹泻的疗效。对于皮肤不良反应，在安乐死前采集小鼠面部和背部皮肤图像。T-QY305处理显著保护面部和背部皮肤免受Gefitinib诱导的最终损伤（图2b,c），并减少Gefitinib诱导的表皮增厚和皮肤炎症评分（图2c,e,f）。更重要的是，T-QY305在增加皮肤水分（皮肤屏障功能指标）方面被证明与米诺环素一样高效（图2g），但米诺环素治疗并不能缓解腹泻。
对于T-QY305的腹泻效果，采用布里斯托大便量表对动物粪便进行评分，它在减少Gefitinib引起的腹泻发生率或严重程度方面表现出显著的效力（图2h）。此外，T-QY305还能减轻结肠上皮的损伤（图2i）。虽然洛哌丁胺降低了Gefitinib引起的腹泻发生率或严重程度，但其副作用是在腹泻和便秘之间找到适当的平衡。
为了进一步研究T-QY305对皮肤和结肠组织中性粒细胞募集的影响，采用免疫荧光法检测中性粒细胞标志物（Ly6G+MPO+）。中性粒细胞免疫荧光结果显示，T-QY305治疗后，皮肤和结肠组织中的中性粒细胞募集减少（图2d,j）。值得一提的是，T-QY305使用并不影响Gefitinib的抗癌功效。更重要的是，经T-QY305处理的小鼠在任何主要器官系统均未观察到与病理相关的明显毒性，体重也没有明显变化。
图2.T-QY305可减轻Gefitinib导致balb/c裸鼠的皮肤不良反应和腹泻
3.T-QY305减轻Gefitinib致BN大鼠皮肤不良反应及腹泻
为了进一步明确T-QY305的疗效，在BN大鼠身上设计了实验组，评估T-QY305是否能同时减轻Gefitinib引起的皮肤不良反应和腹泻。在安乐死前采集了所有大鼠的面部和背部皮肤图像。结果显示，T-QY305对Gefitinib处理大鼠面部和背部皮肤的炎症反应具有显著的抑制作用（图3b,c）。此外结果表明TQY305减少Gefitinib诱导的表皮增厚，对Gefitinib诱导的炎症因子现象和不良炎症细胞浸润皮肤组织有显著疗效。其中炎症细胞因子IL-8（中性粒细胞趋化因子）（图3d）和TNF-α，以及炎症细胞中性粒细胞（MPO+）（图3d）和巨噬细胞（CD68+）表现出剂量依赖性，证实了先前的报道。
在腹泻方面，T-QY305显著改善了食物摄入量，从而减少了Gefitinib引起的体重损失（图3e）。在给予Gefitinib干预后的早期7天内，未观察到T-QY305对腹泻的影响，但从第28天开始，两剂T-QY305能够降低Gefitinib诱导的腹泻评分（图3f）。此外T-QY305还能减少Gefitinib诱导的结肠上皮损伤和杯状细胞数量，减少Gefitinib诱导的炎症细胞因子TNF-α在结肠组织中的浸润（图3g），减少了中性粒细胞（MPO+）（图3g）和巨噬细胞（CD68+）在结肠组织中的募集。
图3.T-QY305可减轻Gefitinib所致BN大鼠皮肤不良反应及腹泻
4.T-QY305纳米结构可能是治疗不良反应的关键成分
根据目前工作的假设，研究中使用的中药（T-QY305）很有可能包含构成T-QY305药效学基础的纳米结构，提取T-QY305中含有的纳米颗粒，标记为N-QY305（图4a），对其进行理化表征，包括平均粒径、表面电荷、形貌特征、稳定性和分散性分析。尺寸和zeta电位分别为240.2±6.4nm和-7.68±0.8mV（图4b）。然后通过透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）成像观察颗粒的形态特征，发现N-QY305具有规则的球形（图4c,d）。进一步通过观察N-QY305胶粒在悬浮液中的光散射效应（Tyndall效应）来分析N-QY305在介质中的分散特性，将N-QY305在不同pH值的缓冲液中孵育1小时，只有在pH为11.0的缓冲液中，N-QY305胶体粒子的光散射才会急剧下降。这表明N-QY305相对稳定，在强碱性条件下可能更容易拆卸（图4e）。
根据现有文献和标准收集的数据，通过液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）鉴定出T-QY305的21个主要成分和N-QY305的13个主要成分（图4f）。与其他成分相比，绿原酸（峰1’）和刺木草苷（峰4’）在皮肤组织中含量最高，与正常组织相比，炎症组织中含量也最高（图4f）。因此，作者认为T-QY305抑制皮肤不良反应和腹泻的能力源于其亚基纳米结构N-QY305，其中N-QY305可介导不良反应的“君”作用，汤剂起“臣”作用，熬制过程起“佐”作用，除N-QY305外其他成分起“使”作用。
图4.N-QY305的制备与表征
5. N-QY305主要通过调节皮肤和结肠组织中性粒细胞浸润来减轻Gefitinib引起的皮肤不良反应和腹泻
利用不同剂量N-QY305对Gefitinib诱导的balb/c荷瘤裸鼠皮肤不良反应和腹泻的影响进行研究，安乐死前采集了小鼠的背部皮肤图像。结果显示，N-QY305还能改善背侧皮肤表型（图5b），降低皮肤炎症评分（图5c），减轻Gefitinib诱导的表皮增厚（图5b,d）。除此之外，皮肤屏障功能指数呈上升趋势（图5e）。N-QY305还可以降低Gefitinib引起的腹泻评分，减少体重损失（图5f,g），减轻结肠上皮的损伤（图5h）。N-QY305对Gefitinib在balb/c裸鼠中的抗癌作用没有负面影响。进一步观察N-QY305的毒性，结果表明N-QY305处理小鼠的体重变化、血浆中AST、ALT、BUN、UA和CRE水平及任何主要器官系统均无明显毒性。以上结果综合来看，N-QY305不仅可以有效减少Gefitinib引起的皮肤不良反应和腹泻，而且在相同剂量下比T-QY305具有更高的疗效。
图5.N-QY305可减轻Gefitinib导致balb/c裸鼠的皮肤不良反应和腹泻
因此接下来对N-QY305如何比T-QY305更好地治疗皮肤不良反应和腹泻进行研究。使用相同剂量的N-QY305和T-QY305比较了炎症皮肤和结肠组织中中性粒细胞募集的比例。与功效结果相似，N-QY305减少皮肤和结肠炎症组织中的中性粒细胞募集，其功效高于T-QY305（图6a,b）。
接下来通过分析迁移白细胞与位于小鼠皮肤表面的趋化因子之间的相互作用，从更深层次的生化角度分析了中性粒细胞募集。由于临床中腹泻的病程短，发生率低于皮肤不良反应，因此仅在皮肤组织中检测了25种趋化因子。结果显示，前两种差异趋化因子均为中性粒细胞特异性趋化因子（图6c,d），Transwell实验证实了N-QY305在体外减少中性粒细胞对CXCL2的募集的有效性，并且在相同剂量下比T-QY305更有效（图6g-l）。这些数据表明，N-QY305对皮肤和结肠组织中CXCL2表达的抑制作用要比T-QY305强得多，最终表现出更好的防止皮肤和结肠组织被中性粒细胞浸润的特性（图6e）。
此外，N-QY305在体外可促进角质形成细胞和结肠上皮细胞的增殖，从而证实其参与了皮肤和结肠组织从治疗损伤中恢复的机制。综上所诉，通过N-QY305治疗皮肤不良反应和腹泻可能会产生积极的结果，即显著抑制皮肤和结肠组织中的中性粒细胞浸润，并修复其受损组织。
图6.N-QY305通过调节中性粒细胞迁移来减轻不良反应
