干货分享|转染效率低？手把手教你做细胞转染实验

干货分享|转染效率低？手把手教你做细胞转染实验

转染效率是判断细胞转染成功的重要指标之一，受到诸多因素的影响，如核酸纯度、细胞密度、生长状态等等，本文将为大家带来完整的细胞转染原理与操作与问题的解决方案。

细胞膜是由磷脂双分子层和镶嵌蛋白组成的，带有负电荷。因此带有负电荷的DNA或RNA无法通过细胞膜。为了让核酸（DNA或RNA）通过细胞膜，研究人员利用不同的方法，包括使用化学物质和包被核酸的载体分子进行中和，以及在细胞膜上开孔等物理方法，将核酸（DNA或RNA）直接运输到细胞内。这些就是转染的过程，转染的目的是促进蛋白合成，调节基因表达，促进细胞生长与发育等，目前越来越多地被用到功能研究中。

根据导入的核酸在目的细胞中存活时间的长短，可以将转染技术分为瞬时转染和稳定转染。也可以根据转染方式的不同，分为化学转染，物理转染、和生物转染方法。例如脂质体转染、阳离子聚合物PEI转染、电转、显微注射、以及慢病毒包装转染等等。

但是，没有一种转染试剂可以满足所有的实验要求。必须根据您的细胞类型（贴壁细胞、悬浮细胞）、外源核酸种类（DNA、RNA）、基因表达时间、细胞毒性、转染效率等，操作是否简便等因素，挑选出最理想的转染试剂。

在细胞转染过程中，即使选对了合适的细胞转染试剂，还是不可避免会出现各种令人头疼的问题，例如，转染效率低，细胞死亡，重复性差等问题。对于这些问题，我们接下来会详细剖析。

转染效率低

转染前

1. 核酸纯度不够，比如DNA/RNA不纯、质粒中含有内毒素、核酸不完整、核酸浓度过低均会导致转染效率低。建议使用高纯度的DNA或RNA有助于获得较高的转染效率。
2. 要检测所用的无血清培养基与转染试剂的相容性，已知CD293, SFMII, VP-SFM 与转染试剂不相容。
3. 用了含有血清的培养基制备转染复合物。血清会降低复合物的形成。建议用无血清培养基稀释DNA/RNA和转染试剂。
4. DNA或RNA的复合物形成的比例，一般DNA（µg）：转染试剂（µL）=1:21:3；而RNA（ng）：转染试剂（µL）=9:13:1。
5. 复合物孵育时间过短，未能充分形成复合物。建议复合物孵育时间10~20 min。
6. 转染试剂保存不当，降低转染效率。保存在4 ºC冰箱，不可冻存，避免反复长时间开盖。

转染时

7. 细胞密度过低或过高。DNA转染细胞密度90%95%，RNA转染细胞密度30%50%。
8. 细胞生长状态不佳。清除支原体、真菌、细菌等污染，保证提供新鲜的生长培养基。
9. 转染时细胞上清液中含有抗生素、生长因子等，大大降低转染效率。

转染后

10. 转染时间过短。一般质粒表达水平在2448h，mRNA表达水平在22472 h，蛋白表达水平在48~96 h。

细胞毒性大

转染前

1. 核酸纯度不纯也会造成细胞毒性。要确保质粒中无内毒素，使用高纯度的DNA或RNA会降低细胞毒性。
2. 转染试剂过量。优化转染试剂的用量，以及优化复合物的比例。
3. 要检查稀释复合物的培养基与细胞的相容性，已知DMEM培养基对一些昆虫细胞系有毒性。建议选择合适的培养基。

转染时

4. 细胞密度过低，会导致部分细胞死亡。DNA转染细胞密度90%~95%，RNA转染细胞密度30%-50%。
5. 细胞生长状态不佳。清除支原体、真菌、细菌等污染，保证提供新鲜的生长培养基。

转染后

6. 转染后目的蛋白的过度表达对细胞产生毒性。建议及时更换新鲜培养基，或者添加一些营养物质。
7. 转染后表达蛋白对细胞产生毒性。建议换一种细胞系重新转染。
8. 转染时间过短，就进行抗性筛选。一般质粒表达水平在2448h，mRNA表达水平在2472 h，蛋白表达水平在48~96 h。
9. 抗性筛选时，加入的抗生素浓度过高。适当降低抗生素的浓度。

重复性差

转染前

1. 移液误差。将DNA/RNA和转染试剂充分打匀后，用移液器缓慢均匀的吸取，避免产生误差。
2. 制备复合物时，未充分混匀。将DNA/RNA和转染试剂轻轻混匀，并保证相同的孵育时间。

转染时

3. 细胞密度存在差异。一般在特定的密度范围内，细胞密度越低，转染效率越低，相反越高。
4. 细胞生长状态存在差异。好的细胞状态，转染效率越高。
5. 细胞传代次数不同。对于多次传代的细胞，细胞的基因组和表型都会发生变化，不建议使用传代次数过多的细胞进行转染实验。

转染后

6. 转染时间不一致，表达的蛋白水平会有差异。

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