八倍体草莓DNA指纹图谱的构建与初步遗传分析

八倍体草莓DNA指纹图谱的构建与初步遗传分析

草莓因其独特的风味和营养价值被誉为“水果皇后”，在中国的栽培面积和产量均位居世界前列。然而，由于品种命名混乱和营养繁殖特性，同名异物或同物异名的现象时有发生。为了解决这一问题，研究人员利用分子标记技术构建了八倍体草莓的DNA指纹图谱，为品种鉴定和新品种选育提供了技术支持。

草莓（Fragaria ananassa Duch.）是一种重要的经济作物，因其独特的风味和较高的营养价值素有“水果皇后”的美誉。中国是世界上草莓主要生产国之一，2020年我国草莓栽培面积和产量分别为12.66万公顷和332.68万吨，占世界种植面积和产量的32.92%和37.54%。我国野生草莓资源丰富，自然分布的草莓属植物约有13种，分别为二倍体和四倍体，20世纪初八倍体的栽培草莓凤梨草莓传入我国，目前为止已从国外引进八倍体草莓品种上百个，其中以日本品种和欧美品种居多。近年来我国自主繁育的品种逐年增加，截至2017年，我国草莓育种单位育成品种112个。由于我国草莓种植区分布广泛，不同地区均存在引种现象，品种命名混乱，加上草莓本身的营养繁殖特性，同名异物或同物异名的现象时有出现。因此，使用分子技术手段准确区分现有草莓品种资源很有必要。

利用分子标记技术构建DNA指纹图谱，能够从遗传本质层面对品种进行鉴别和保护，中国已将利用DNA指纹图谱辅助草莓新品种测试列为重要发展方向。简单重复序列标记（Simple sequence repeat，SSR）具有多态性丰富和稳定性好等特点，国内外学者开发了大量SSR标记用于草莓品种鉴定、遗传多样性分析及指纹图谱构建等研究。传统SSR扩增产物需要经过银染显色等复杂工序，步骤繁琐费时，而毛细管电泳荧光检测方法具有操作简便和灵敏度高的优势，可克服这一难题。本研究拟利用最新SSR引物结合毛细管电泳技术对收集的84个八倍体草莓资源进行DNA指纹图谱构建和遗传分析，以期为草莓资源保护、品种鉴定和新品种选育提供技术支持。

试验材料与方法

试验材料包括欧美、日韩及我国选育草莓品种，共计84份。现种植于山东普朗特农业技术有限公司，样品信息见表1。

取草莓幼嫩叶片，加入液氮，用组织研磨仪研磨成粉末，采用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA。提取的DNA用适量TE缓冲液溶解，使用微量紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度，置于-20℃保存。

参考苗立祥等的研究方法，选用59对引物对部分样品进行扩增。选择条带清晰、单一和扩增多态性较好的18对引物对所有样品进行PCR扩增。上游引物连接M13引物序列，以便与荧光标记的M13引物进行互补配对。M13引物序列参考贾琳琳等。普通引物和荧光引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

PCR反应体系总体积20μL：10×Buffer 2.0μL，2.5mmol/L dNTPs 2μL，5U/μL Taq酶0.2μL，10μmol/L M13荧光引物1μL，1μmol/L上下游引物mix 1μL，DNA模板2μL，用去离子水补足20μL。PCR反应程序：95℃模板预变性5min，1个循环；95℃模板变性1min，62℃～52℃每循环降低1℃，72℃引物延伸45s，共10个循环；95℃模板变性1min，52℃复性结合45s，72℃引物延伸45s，共25个循环；最后60℃延伸30min，16℃保存。PCR结束后，取产物1～2μL，加入含有ROX500内标的甲酰胺10μL，95℃变性5min，在ABI 3730XL DNA分析仪上进行荧光检测。检测结果通过GenemapperV4.0软件进行片段大小和基因型分析。

检测产物明显峰值按照四舍五入取整数记录片段大小，将这些引物扩增主要片段带型进行组合，即为品种的DNA指纹图谱。将数据通过DataFormater2.7软件转换为NTSYS软件要求的数据格式。利用NTSYSpc 2.1软件（http://www.appliedbiostat.com/）SM (Simple matching)法计算其遗传相似系数，然后根据相似系数用SAHN Clustering和非加权成对算术平均法（Unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA）进行聚类分析。多态信息含量（Polymophism information content, PIC）为某一标记在群体中出现的频率，反映该标记在群体检测多态性的价值。根据Nei方法计算引物PIC值：PIC=1-ΣPi2，其中Pi为第i等位变异的频率。

结果与分析

选用DNA提取量较大，编号为9～15的7个草莓样品对59个SSR引物进行筛选。经毛细管电泳检测，选出18对多态性好和扩增信号强的引物，引物名分别为：S0011、S0051、S0061、S0121、S0181、S0231、S0291、S0301、S0331、S0341、S0351、S0471、S0491、S0611、S0641、S0701、S0791和S0971，这些引物分别编号P1～P18。每对引物扩增产物相对片段大小基本与此前苗立祥等研究公布的一致（表2）。引物P10和P11在部分草莓品种中检测的不同类型的等位变异峰见图1。样品‘红太后’‘宫本7号’‘绥陵’‘胡得’经引物P10扩增得到的带型组合分别为205、192/266、260/266和205/272，而‘贺登’‘新星2号’‘静香’‘肇国’经引物P11扩增得到的带型组合分别为200/223、197、195/250和223/250。

图1 引物P10(a)和P11(b)对部分草莓样品扩增峰图

使用18对SSR荧光标记引物对84份草莓品种进行扩增，共得到156个条带。其中多态性条带150个，不同引物扩增到的多态性条带数为4～17个，多态性条带带型总数为377个。采用遗传多样性分析各引物的PIC值范围为0.494～0.908，平均值为0.738（表2）。说明这些引物多态性较高，可用于对这些草莓品种进行多态性分析。

为便于记录，将18对SSR引物P1～P18分别编号为A～R，每对引物在84个草莓品种中扩增出的带型，按照条带的个数从少到多（条带个数相同的按照分子量从小到大）排序，依次将不同的带型标注为1、2、3、…，再将每个品种在18对引物上扩增带型进行对应的数字编码，将引物编号与相应的带型编码进行组合得到该样品在特定引物的扩增产物编码，18对引物顺序串联这些编码形成该品种的DNA指纹图谱。如P1共扩增带型数20个，按照以上原则进行编号分别为1：250，2：254，3：258，4：262，5：241/250，6：241/254，7：241/258，8：241/262，9：243/250，10：243/254，11：243/258，12：243/262，13：243/278，14：250/254，15：250/258，16：250/262，17：254/258，18：254/262，19：258/262，20：258/266。例如：1号样品‘小桃红’由P1扩增到多态性带型为250/254，对应第14种带型，因此引物P1对‘小桃红’扩增带型编码为A14；引物P2共扩增带型数24个，该引物扩增‘小桃红’的带型为176/185/188/197，对应第17种带型，则引物P2对‘小桃红’扩增带型编码为B17。按照同样原则，将其他引物对‘小桃红’的扩增带型进行编码，按照P1～P18引物顺序将带型编码进行组合，得到‘小桃红’的指纹代码为A14B17C25D5E10F4G15H8I17 J1K7L18M7N35O14P12Q6R1。按照此方法建立了84个草莓品种的DNA指纹图谱数据库。

基于18对SSR引物对84份草莓品种进行聚类分析（图2）表明，84份草莓品种资源的遗传相似系数范围为0.61～0.99，一些品种之间相似系数接近0.99，如‘红富美’‘红珍珠’、‘福特拉米’‘红太后’和‘胡得’‘格林1号’。聚类结果显示一些来源接近的品种聚在一起，如红花草莓‘小桃红’‘粉佳人’，我国的地方品种‘丹东大果’‘石头河子’聚在一起，‘荷兰西峡’‘荷兰草莓’聚在一起。在遗传相似系数为0.74处可把供试品种划分为4个主要类群。第I类有7个品种，欧美3个、我国3个和日本1个；第II类有17个品种，以欧美品种为主（12个），还包括广泛用作育种亲本的日本‘红颜’草莓以及我国培育的‘京怡香’草莓，‘红颜’是‘京怡香’的亲本之一；第Ⅲ类包括11个品种，其中欧美品种有6个，‘红富美’‘红珍珠’‘加拿大四季’聚在一起，欧美品种‘西5’‘贺登’和日本品种‘宫本7号’聚在一起，推测这些草莓可能具有较近的亲缘关系；第Ⅳ类共49个品种，其中欧美品种17个，我国品种22个，日本和韩国品种共10个，包括市场主栽草莓品种‘甜查理’‘红袖添香’‘妙七’‘香野’等。我国地方品种‘丹东大果’‘石头河子’与我国选育品种遗传距离较远。

图中序号对应的草莓品种详见表1。I～IV表示在遗传相似系数0.74处84个草莓品种所聚类成的4个类群。

图2 基于18对SSR标记的84个草莓品种聚类分析树状图

讨论与结论

经过不同渠道引进国外草莓资源以及各地频繁引种，导致我国草莓名称容易出现同物异名或同名异物等现象。如本研究中的草莓品种‘都卡’疑似为荷兰品种‘因都卡’（Induka），草莓品种‘红岗特利德’（Red gauntled）有研究称为‘红岗利特德’或称为‘红手套’。因此，对于国外引进品种有必要规范品种名称，建议从国外引进的品种可直接记录英文名称，避免出现命名混乱的情况。另外，对于品种名称不确定的资源，可以通过建立DNA指纹图谱来区分不同品种。本研究构建了84个草莓品种的DNA指纹信息数据库，为这些草莓品种准确区分提供了方法。

本研究所用的SSR引物选自苗立祥等基于草莓基因组序列开发的，从中筛选出的18对引物多态性较好，对84个草莓品种扩增条带数和片段范围与苗立祥等报道的有些差异，其原因除了苗立祥等引物直接标记荧光而本研究使用M13荧光引物之外，还可能跟所用试验材料不同有关。许多研究者应用荧光SSR标记的毛细管电泳技术检测的方法构建了小麦、高粱和水稻等作物的指纹图谱，黄志城等参照小麦指纹编码方法，按照固定引物顺序，串联各带型编码，形成1组代表该品种的数字信息，构建了中国草莓已知品种DNA指纹信息数据库。本研究参考前人的方法对每对引物扩增草莓样品的带型进行编码，但与前人研究的区别在于之前研究中带型编码以数字1～9和英文A～Z（记录10以上的带型）表示，所以指纹信息中每一位数字或字母代表每个引物的扩增带型信息，如第2位数字或字母代表第2个引物扩增的带型特征；而本研究中仅以数字记录带型，首次将引物进行编号，引物编号与相应的带型编码进行组合得到该样品在特定引物的扩增产物编码，按照18对引物顺序串联这些编码形成该品种的DNA指纹图谱。与前人指纹图谱编码方法相比，本研究采用的编码加入引物编号，使编码更方便，不易出错。

本研究基于18对SSR引物建立了84份草莓品种资源的遗传关系，品种间遗传相似系数范围为0.61～0.99，与韩柏明等利用18对SSR引物研究96份草莓资源的相似系数在0.62～1.00的研究一致。说明现有草莓品种之间亲缘关系较近，可能与常规杂交选育新品种的方式有关。本研究中聚类分析发现，我国选育的品种与国外品种混杂在一起，其可能原因是我国选育品种和地方品种及日本品种都直接或间接来源于欧美品种，导致遗传基础狭窄。因此今后我国草莓育种应收集利用更多种质资源，尤其是野生资源，拓宽草莓品种遗传基础，为培育出优质的草莓新品种奠定基础。

本文原文来自知猫