微生物限度检测：标准与流程详解

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@小白创作中心

微生物限度检测：标准与流程详解

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来源

https://www.bjhgyjs.cn/news/qitajiance/2025/0313/27775.html

微生物限度检测是评估药品、医疗器械、食品及化妆品等产品中微生物污染水平的重要手段，旨在确保其符合卫生安全标准。本文基于《中国药典》2020版四部通则1105/1106、ISO 11737-1（医疗器械灭菌微生物方法）及GB 4789.2-2022（食品微生物检验）等标准，系统介绍了微生物限度检测的核心项目、标准限值、检测流程、关键设备、方法验证、常见问题及解决方案等内容。

核心检测项目与标准限值

检测类别	关键参数	检测方法	判定标准
需氧菌总数（TAMC）	需氧菌及兼性厌氧菌菌落计数	平皿法（TSA培养基，30-35℃×35天）	口服制剂≤10³ CFU/g（中国药典）
霉菌和酵母菌总数（TYMC）	霉菌与酵母菌菌落计数	SDA培养基（20-25℃×5-7天）	非无菌制剂≤10² CFU/g
控制菌检查	大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌等	选择性培养基+生化鉴定（如麦康凯琼脂、BP平板）	不得检出（药典规定）
耐胆盐革兰阴性菌	特定肠杆菌科细菌检测	肠道菌增菌液（EE肉汤）+VRBG琼脂	医疗器械≤10 CFU/件（ISO 11737）

标准化检测流程

1. 样品前处理

药品/化妆品：
液体样品：直接取样或稀释（pH 7.0 PBS）；
固体样品：均质（拍打式均质器，200rpm×2min），制成1:10悬液。
医疗器械：
洗脱法：超声处理（40kHz×30min）或震荡洗脱（含中和剂的PBS）；
膜过滤法：样品浸提液通过0.45μm滤膜，滤膜贴于培养基。

2. 微生物计数（平皿法）

倾注培养：
取1mL样品液加入无菌平皿，倒入TSA/SDA培养基（45-50℃），摇匀凝固；
TSA（需氧菌）：30-35℃培养35天；SDA（霉菌/酵母菌）：20-25℃培养5-7天。
菌落计数：
选择菌落数30-300 CFU的平皿，计算平均值；
计算公式：菌落数(CFU/g或mL)=平均菌落数×稀释倍数/样品量

3. 控制菌检查（以大肠埃希菌为例）

增菌培养：样品液接种于麦康凯肉汤（37℃×24h）；
分离培养：划线接种麦康凯琼脂（37℃×24h），观察粉红色菌落；
生化确认：IMViC试验（吲哚+/甲基红+/VP-/枸橼酸盐-）。

关键设备与耗材

设备/耗材	用途	推荐型号/品牌
拍打式均质器	固体样品均质化	Seward Stomacher® 400 Circulator
微生物培养箱	需氧/厌氧环境培养	Memmert INCOmed（温控精度±0.5℃）
膜过滤系统	低微生物负荷样品浓缩检测	Milliflex® Quantum（默克）
菌落计数器	自动菌落识别与统计	Synbiosis ProtoCOL 3
选择性培养基	控制菌分离（如BP琼脂、XLD琼脂）	海博生物（HB0388/XLD培养基）

方法适用性验证

1. 回收率测试

接种已知浓度标准菌株（如金黄色葡萄球菌ATCC 6538）至样品中，计算回收率；
要求：需氧菌回收率≥70%，控制菌应100%检出。

2. 干扰物质中和

含抑菌性样品需添加中和剂（如聚山梨酯80、卵磷脂）；
验证方法：比较添加中和剂前后的微生物回收率差异（应无显著抑制）。

常见问题与解决方案

问题现象	可能原因	改进措施
平皿菌落过度生长	样品微生物负荷过高	增加稀释梯度（如10⁻³→10⁻⁵），优化取样量
回收率低	样品残留抑菌成分未被中和	调整中和剂类型（如吐温80+组氨酸），延长中和时间
控制菌假阴性	选择性培养基灵敏度不足	更换高选择性培养基（如ChromID™沙门菌显色培养基）
霉菌污染扩散	培养环境湿度过高或交叉污染	使用独立培养箱分隔霉菌样品，控制湿度≤60% RH