人肠类器官冻存与复苏技术指南

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@小白创作中心

人肠类器官冻存与复苏技术指南

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来源

http://www.pbmedicals.com/index.php?a=new_nav_list&m=article&newid=300

类器官相关研究

冻存人肠类器官

本操作流程适用于每管冻存和复苏200个类器官。为达到最佳的结果，冻存应在类器官成熟（传代7-10代）后进行。

注意：肠类器官从原代建立后，至少应进行两次传代后才适宜进行冻存；为达到最佳效果，应使用成熟的并具有多芽的类器官。相比小的、暗的类器官，较大的隐窝和芽状器官会形成更高产量的碎片（图6）。

将不含钙和镁离子的PBS ，含15mM HEPES的DMEM/F-12 和CryoStor® CS10 置于冰上。
使用倒置显微镜，对每孔的成熟类器官进行计数。为保证每管中含有200个类器官，可将几孔的培养物合并冻存。
吸出培养孔中的IntestiCult™类器官生长培养基。加入1mL冷的（2 – 8℃）D-PBS。
使用D-PBS预先湿润1mL的枪头，上下吹打10 – 20次吹散Matrigel® 基质。将含有200个类器官的混合物转移至1个15mL的离心管，如需要可合并几个培养孔。
使用预先湿润的1mL的枪头，将1mL冷的（2 – 8℃）D-PBS加入每孔进行清洗，上下吹打5次，转移至第4步的离心管中。
以290 x g，2 – 8℃离心5分钟。小心去除上清液，不要接触到沉淀的类器官。
使用7 – 10mL冰冷的含有15mM HEPES的DMEM/F-12重悬类器官沉淀。轻柔的敲打离心管，或者使用枪头轻柔的吹打，吹散沉淀。再以200 x g，2 – 8℃离心5分钟，小心去除上清液。
使用1mL冰冷的（2 – 8℃）CryoStor CS10重悬类器官沉淀，每管冻存200个类器官。

注意：操作迅速，尽量缩短未冻存的类器官与CryoStor CS10的接触时间。

使用同一个枪头，将含有类器官的CryoStor CS10转移至预先标记好的冻存管中。将冻存管放入具有500mL异丙醇的细胞冻存盒或不含IPA的冻存盒。
将细胞冻存盒置于-80℃冰箱24小时后，将细胞冻存管转移至液氮（-135℃）中进行长期的储存。肠类器官可在-135℃下冻存6个月。不建议在-80℃进行长期储存。

图6.人肠类器官冻存 用于冷冻保存的人类肠道器官应在其成熟后，大约7-10天后冷冻保存。为了取得最好的效果，应该使用较大的隐窝或芽状器官（红色圈）。较小的、黑暗的或塌陷的器官（蓝色圈）可能不能提供可接受的解冻后生存能力

肠类器官复苏

冰上解冻120μL Matrigel 基质，将预先配置好的完全IntestiCult类器官生长培养基预热至室温（15~25℃）。24孔板的4个培养孔需要3.1mL完全培养基。配制完全培养基，试剂准备。将所需的TC处理的24孔培养板置于37℃孵箱预热 30分钟。
将2mL的25% BSA母液与48mL含有15mM HEPES的DMEM/F-12 混合于一支50mL的离心管中，用于配置含有 1% BSA的DMEM/F-12清洗液。操作过程中，室温（15 – 25℃）保存。本清洗液可于2~8℃保存6个月。
将2mL含有1% BSA的DMEM/F-12加至一个15mL离心管中，放于室温（15 ~25℃）。

注意：为避免影响细胞活率，细胞应当马上转移至该离心管中。

拿出冻存的类器官，置于37℃水浴中。当冻存液变为液体，解冻即完全，此时应在管底观测到类器官。在37℃解冻大概需要 2~ 2.5分钟，培养物过热会影响类器官的复苏效率。

注意：解冻后立即进入下一步，以避免活力显著下降。不建议将类器官暴露于连续复苏 – 冻存的循环中。

打开前，使用70%酒精或异丙醇擦拭冻存管外部。使用1mL枪头将1mL含有1% BSA的DMEM/F-12直接加入管中。上下吹打4次，将冻存管中的内容物混匀。立即使用预先湿润的1mL枪头将冻存管中的内容物转移至第3步的离心管中，即含有2mL 1% BSA的 DMEM/F-12。
用2 x 1mL含有1％ BSA的DMEM/F-12将细胞冻存管清洗两次，然后转移到离心管中。务必清洗到细胞冻存管的整个内表面区域，包括盖子内部。
以200 x g，2 – 8°C离心5分钟，去除CryoStor CS10。小心去除上清液。避免产生气泡。如果离心后存在气泡，则在吸出上清液体之前，先小心地吸去气泡。
使用200μL枪头，加入100μL室温（15 ~25℃）的完全 IntestiCult™器官生长培养基重悬类器官。
使用200μL枪头加入100μL Matrigel。上下吹打5 – 10次，混匀培养物，以确保整个样品的密度和粘度一致。避免产生气泡。
使用预先湿润的200μL枪头，吸取50μL，并加入到提前预热的24 孔板其中四个孔中的中心部位。为了防止接种时出现气泡，在使用移液枪时指压到第一段（不要按到底部）。于37℃，5％ CO2下孵育10分钟，使Matrigel固化。
使用移液枪沿着孔侧壁向每个孔中轻轻地加入750μL预热至室温（15~25℃）的完全IntestiCult™类器官生长培养基。不要将培养基从dome上直接加入。
将无菌D-PBS加至其它未接种dome的孔中。将培养板的盖子盖好，并在37℃和5％ CO2下进行培养。每周进行三次完全换液。
为了获得最佳结果，解冻后应对冻存的类器官进行两次传代。冷冻后，类器官生长变慢。类器官通常在传代后5~10天进行传代（图7）。通常类器官的生长速度应在一次传代后恢复（图7）。