CRISPR-Cas12a：一款强有力的检测识别工具
CRISPR-Cas12a：一款强有力的检测识别工具
CRISPR-Cas12a技术是近年来生物技术领域的重要突破之一，它不仅在基因编辑领域展现出巨大潜力，还在病原体检测领域开辟了新的应用方向。本文将为您详细介绍CRISPR-Cas系统的发现历史、工作原理以及CRISPR-Cas12a在病原体检测中的具体应用，帮助您全面了解这一前沿生物技术。
CRISPR-Cas系统的发现与组成
簇状规则间隔短回文重复序列（CRISPR）最早于1987年在日本研究人员在K19大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近被发现，后来被证实广泛存在于细菌等原核生物中。2002年，这一发现被正式命名为CRISPR。CRISPR系统起源于细菌和古细菌的适应性免疫系统，用以对抗质粒、噬菌体等外来移动遗传因子的攻击。
CRISPR系统主要由CRISPR簇（相似长度的重复序列加上间隔序列）、前导序列L和CRISPR相关的Cas蛋白（CRISPR-Cas）组成。其免疫过程可分为三个阶段：适应阶段、表达阶段和干扰阶段。在适应阶段，CRISPR系统将入侵病毒等外来DNA片段作为间隔物插入CRISPR簇中；在表达阶段，CRISPR簇被转录成前体RNA，经过加工后成为成熟的CRISPR RNA（crRNA）；在干扰阶段，crRNA引导Cas蛋白形成更大的核糖核蛋白复合物，特异性靶向并切割同源病毒或质粒的核酸。
CRISPR-Cas系统的分类
CRISPR-Cas系统共分为两大类，再往下又可细分为六种类型（Ⅰ类~Ⅵ类）和33个亚型。其中1类系统（Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型）在其CRISPR核糖核蛋白效应物核酸酶中使用多个Cas蛋白，而2类系统（Ⅱ型、Ⅴ型、Ⅵ型）使用单个Cas蛋白。1类CRISPR-Cas系统在细菌和古细菌当中最为常见，所占比例在所有已鉴定CRISPR-Cas基因座中高达90%。2类CRISPR-Cas系统包括剩余的10%几乎只存在于细菌中，并组装成一个核糖-核蛋白复合物，由crRNA与Cas蛋白组成，crRNA包含靶向特定DNA序列的信息。
CRISPR-Cas12a在病原体检测中的应用
目前所流行的Cas9与Cas12a系统均属于2类，CRISPR-Cas12a为一种由crRNA所引导的内切酶，是一种RNA引导的系统，被归类为Ⅴ型。CRISPR-Cas12a系统的检测流程包括两个阶段：1.检测样本的核酸扩增和构建；2.反应和CRISPR系统的演示。采用PCR、等温扩增等低成本技术扩增核酸分子，而CRISPR系统的指数扩增、快速识别和裂解提高了检测效率。CRISPR-Cas12a系统的显示部分可用荧光信号、LFA条带、芯片等，使检测结果更容易理解甚至可视化，并且还能够进行多重检测以提高检测效率。将不同类型crRNA与Cas酶结合，使用同一系统可同时检测多个靶点。
图1 CRISPR/Cas12a系统免疫流程
CRISPR-Cas12a技术的优势与挑战
CRISPR-Cas12a技术在检测方面具有一定突出优势，但CRISPR-Cas12a检测法在推广的同时也不可避免地存在着一些技术障碍方面的缺陷。目前扩增及检测被应用到多种病原体检测策略中，将扩增子转移到检测平台是一个必要步骤，不过在此过程中易产生气溶胶及造成其他类型的污染。由于在实际应用中遇到的食品、动物和病理样品组成复杂，需要检测的核酸浓度可能较低，因此样品预处理这一环节至关重要。除此之外对检测所需的仪器、设备、环境等方面的要求也同样不容忽视，需依据实际情况来决定是否可行并选择最佳方案。
应用案例
运用CRISPR-Cas12a技术所研发的核酸试纸条已实现布鲁氏菌感染菌株中野毒株和S2疫苗株的鉴别诊断，可用于布鲁氏菌感染菌株现场筛查，准确捕杀真正感染布鲁氏菌的动物。
图2 CRISPR-Cas12a试纸条显色鉴别试剂盒（“N”代表阴性）
未来展望
CRISPR-Cas12a是CRISPR-Cas12家族中使用最频繁的一种，由于顺势疗法和反切割特性，它为生物传感器设计提供了多种选择。由于受体可用性和实用性的限制，基于CRISPR-Cas12a的生物传感器的特异性和灵敏度还有待进一步提高。此外新开发的基于CRISPR-Cas12a的应用和方法推动了众多诊断和检测解决方案的发展，CRISPR/Cas12a与其他IA技术相结合的检测结果表明，CRISPR/Cas12a联合IA技术的检测法在开发下一代核酸检测生物传感器、医疗诊断、环境监测等方面具有巨大的潜力。总之，CRISPR-Cas12a技术彻底改变了对细菌的研究。我们预计新的CRISPR技术的发现将会进一步增强我们对生命的理解，以及对生物体进行基因改造的能力。
本文原文来自公众号“生物化学与生物物理进展”，中国生物物理学会官方订阅号。