高通量单分子定位显微成像技术进展
高通量单分子定位显微成像技术进展
高通量单分子定位显微成像技术是近年来发展迅速的超分辨成像技术之一，它不仅突破了传统光学显微镜的分辨率限制，而且能够在较短时间内获取大量生物样本信息。本文综述了该技术的最新进展，包括硬件扫描拼接成像、基于大面阵相机的非拼接式成像、大景深单分子定位技术以及高通量数据分析等方面的研究成果。
封面解读
本封面体现了高通量超分辨技术的优势：兼具超大视场范围与超高分辨率，可以在观察亚细胞结构的同时探究不同细胞种群之间的差异，对跨尺度成像意义非凡。
1.背景
由于衍射极限的存在，传统的光学成像手段无法观测细胞器结构及细胞器之间的相互作用。单分子定位显微成像技术作为三种超分辨技术中分辨率最高的成像技术，通过让视场范围内的荧光分子在时序上随机稀疏地激活发光，利用定位算法拟合单分子点的空间位置，在多次循环采集的过程中逐渐完成对所有单分子点的定位。因为“随机”、“稀疏”的特性，该技术使得在同一时刻基本不会有空间距离上很近的单分子点同时发光，从而实现了超分辨成像。大视场高通量单分子成像技术具有分辨率高、成像范围大和成像时间短等特点，可以在观察亚细胞结构的同时探究不同细胞种群之间的差异，对跨尺度成像意义非凡。
2.基于硬件扫描的拼接成像技术
为了对生物问题进行研究，最初采用了移动样品位移台，对样品的多个子区域进行成像，通过引入自动锁焦机制，保持系统的稳定性，最后将每个子区域的图像拼接起来，实现了高通量成像。2018年，Mund等[1]设计出一种高通量超分辨显微镜，在样品上划分100~500个区域，对于每一个感兴趣的子区域，预定义一组激光强度、透镜和滤光片位置实现自动采集。虽然硬件扫描能实现大视场高通量成像，但是利用硬件扫描的拼接成像技术的成像效果往往受位移台的精度、拼接算法等因素影响。
3.非拼接式的高通量大视场成像技术
（1）基于大面阵相机的非拼接式成像
随着CMOS技术的不断成熟，sCMOS传感器因具有极高的读取速度、较大的动态范围和较多的传感单元数量等优势逐渐取代了EMCCD传感器，应用于超分辨成像领域。在基于sCMOS的高通量大视场成像中，高斯光束无法提供均匀且足够强度的照明。因此，需要光束整形、多模光纤和波导技术等方法来实现均匀照明，以确保成像视场内均匀的分辨率。如图一所示，Diekmann[2]等提出了一种基于波导的Waveguide-TIRF技术，用于实现大视场均匀TIRF照明。该技术利用TIRF照明的光学切片特性，降低了背景噪声强度，提高了信噪比和分辨率。Mau等[3]利用振镜对光斑较小的高斯光束在200 μm×200 μm的视场范围内进行二维扫描。
图1 Waveguide-TIRF技术原理[2,4,5]。(a)波导结构示意图；(b)波导内激光路径示意图；(c)波导内激光产生倏逝波照亮样本；(d)光学系统示意图；(e)传统TIRF照明技术与Waveguide-TIRF照明技术的对比
（2） 大景深单分子定位技术
由于传统的高斯点扩散函数在焦平面前后呈对称的光场分布，因此无法仅通过点扩散函数的形状判断单分子点位于焦平面的哪一侧。除此之外，高斯点扩散函数的较小景深与较小轴向光场变化幅度意味着，在一次成像中只能拍摄到焦面附近的单分子点。为了克服这一问题，研究者们提出了包括点扩散函数工程、远聚焦、物镜扫描的多种技术路线。
点扩散函数工程是一种通过在成像光路中加入相位板、空间光调制器、可变形镜等光学元器件，引入像差来调制系统的点扩散函数，使其适用于高通量三维成像的技术。2022年，本课题组[6]利用可变形镜（DM）调制系统的点扩散函数如图2所示，通过对DM每个促动器的精确校准，优化出适用于DM的大景深DMO-Tetrapod点扩散函数，定位精度相较于传统Tetrapod点扩散函数提升约20%~30%。Tetrapod点扩散函数在保证较高定位精度的情况下，景深范围最大可以达20 μm。这无疑极大地提高了系统的成像通量，有着广阔的应用范围。
图2 利用可变形镜优化系统的点扩散函数[6]
在远聚焦成像系统中，系统中的前两个物镜将焦平面附近的空间光场“投影”在第三个物镜的焦点处，通过移动第三个物镜改变其焦平面位置，从而可以实现对较大景深范围内的任一平面成像。其他改变焦平面的方法还包括利用DM、电动可调焦透镜（ETL）等的方式，如图3所示。
图3 基于可变形镜或ETL透镜的远聚焦技术原理[7,8]。（a）~（c）基于可变形镜的远聚焦技术的原理； (d)基于ETL的远聚焦技术的原理
4.高通量数据分析
sCMOS数据采集通量高于传统的EMCCD，高像素带来的海量数据大大增加了数据处理压力。为了减少单分子定位技术的整体成像时间，目前常用高性能GPU加速、计算集群等方法。
2023年本课题组[9]提出了一种基于深度学习的单分子定位系统中的大视场像差校正方案，即FD-DeepLoc，发现了深度学习在改善单分子定位技术成像质量方面的潜力。FD-DeepLoc 的训练过程如图4(a)所示，将采集到的有像差的单分子数据按其在视场中的位置分为几个子区域，将子区域与其在整个视场中的位置信息传入预训练好的网络中，将输出较为准确的单分子定位结果。FD-DeepLoc实现了180 μm×180 μm×5 μm范围无须扫描的全细胞超分辨成像，将三维SMLM的成像通量提升了约100倍。利用FD-DeepLoc对大视场内的神经元细胞以及大量轴突片段进行了观测，其骨架周期状分布清晰可见如图4(b)所示。同时也实现了对多个细胞线粒体的超分辨大景深成像，完整重构了其多层次三维中空结构如图4(c)所示。
图4 a, FD-DeepLoc训练流程示意图。b, FD-DeepLoc在大视场上对神经元进行高质量的三维超分辨率重构。cdef, 分别是b中矩形区域的放大图，f234对应f1的不同轴向范围（0-1 μm，1-2 μm，2-3 μm）。g，FD-DeepLoc在大视场上对多个细胞线粒体的大景深三维超分辨重构。h，g中矩形区域放大图。i，h中虚线区域的轴向侧视图。比例尺，50 μm (b, g)，10 μm (h), 1 μm (c, d, e, f, i)[9]
5.总结
随着单分子成像技术的不断成熟，高通量的单分子成像逐渐受到研究者的重视与青睐。较高的通量意味着研究者可以在单次成像或者更短的时间内获取更多的生物样本信息，极大提高了研究效率，甚至使得同时研究亚细胞生命活动与不同细胞种群之间的差异成为可能。在现有阶段，为了进一步实现更大通量的单分子定位成像，可以从以下几个角度出发：在激发照明方面，将高功率激光与激发光扫描技术相结合，以实现更大区域的照明，采用快速闪烁染料提高成像速度；在成像光路方面，调制系统点扩散函数以获得适合大视场低采样率的点扩散函数，以提高定位精度；在数据处理方面，利用深度学习进一步矫正更大视场范围的场相关像差等；在系统设计方面，利用高密度成像并配合基于深度学习的数据分析来减少成像所需总帧数，以提高成像速度及通量。总的来说，探究单分子定位技术的高通量可能性是极具研究价值与工程价值的一个研究方向，涉及关于成像系统从激发照明、成像光路、数据分析等方面的多角度、全方位优化，展现出具大的研究潜能与应用价值。
参考文献
[1] Mund M, Van Der Beek J A, Deschamps J, et al. Systematic Nanoscale Analysis of Endocytosis Links Efficient Vesicle Formation to Patterned Actin Nucleation[J]. Cell, 2018, 174(4): 884-896.e17.
[2] Diekmann R, Helle Ø I, Øie C I, et al. Chip-based wide field-of-view nanoscopy[J]. Nature Photonics, 2017, 11(5): 322-328.
[3] Mau A, Friedl K, Leterrier C, et al. Fast widefield scan provides tunable and uniform illumination optimizing super-resolution microscopy on large fields[J]. Nature Communications, 2021, 12(1): 3077.
[4] Ramachandran S, Cohen D A, Quist A P, et al. High performance, LED powered, waveguide based total internal reflection microscopy[J]. Scientific Reports, 2013, 3(1): 2133.
[5] Archetti A, Glushkov E, Sieben C, et al. Waveguide-PAINT offers an open platform for large field-of-view super-resolution imaging[J]. Nature Communications, 2019, 10(1): 1267.
[6] Fu S, Li M, Zhou L, et al. Deformable mirror based optimal PSF engineering for 3D super-resolution imaging[J]. Optics Letters, 2022, 47(12): 3031.
[7] Navikas V, Descloux A C, Grussmayer K S, et al. Adaptive optics enables multimode 3D super-resolution microscopy via remote focusing[J]. Nanophotonics, 2021, 10(9): 2451-2458.
[8] Basumatary J, Baro N, Joshi P, et al. Scanning single molecule localization microscopy (scanSMLM) for super-resolution volume imaging[J]. Communications Biology, 2023, 6(1): 1050.
[9] Fu S, Shi W, Luo T, et al. Field-dependent deep learning enables high-throughput whole-cell 3D super-resolution imaging[J]. Nature Methods, 2023, 20(3): 459-468.
本文原文来自《激光与光电子学进展》