Nature子刊：无需外源性DNA，逆转录蛋白也能实现转基因
Nature子刊：无需外源性DNA，逆转录蛋白也能实现转基因
近年来，基于CRISPR-Cas9的基因编辑技术迅速发展，其不仅被用于关注定点修饰的「基因编辑」，也被用于引入新基因的转基因系统内。无论是基因编辑还是转基因工具，它们大多需要往宿主细胞中引入各种基因编辑模块，外源性DNA的引入在临床使用中不仅可能会诱发免疫响应，还可能引入更多的负面突变。而随着新冠疫情的肆虐，基于RNA的疗法愈发受到医学界的重视。
那么，有没有一种RNA工具能够以更低的风险实现高效的转基因或者基因编辑呢？这成为了一些科学家们希望攻克的下一个难题。
图片来源：Nature Biotechnology
垃圾基因中的瑰宝
2024年2月20日，来自加州大学伯克利分校的研究团队在Nature子刊Nature Biotechnology上刊登了题为Harnessing eukaryotic retroelement proteins for transgene insertion into human safe-harbor loci的研究，报道了他们如何利用逆转录蛋白开发出了一项名为PRINT的新型转基因技术。
本次突破并不是该研究团队首次在逆转录蛋白领域发表重磅论文。就在短短3个月前，该团队就在Nature上报道了他们对名为LINE-1的逆转录转座子的研究。LINE-1在结合切口酶后能通过其逆转录机制实现基因的插入。但由于其插入的位点可能干扰到正常的基因且编辑效率较低，研究人员认为LINE-1不适合用于基因治疗。可对LINE-1机制的研究是还是为研究团队带来了新的思路。如果他们能找到一种能够只向安全区域引入基因的逆转录转座子，并提高它的编辑效率，那他们完全有可能得到一个全新的转基因工具。
逆转录转座子可以通过将RNA逆转录为DNA在基因组中实现跳跃与复制，它们在自然界中也并不罕见。人类基因组的40%就是由这些「自私」的序列组成，但绝大部分逆转录转座子都失去了其生理学功能，是名副其实的「垃圾基因」。而就是在这堆垃圾中，研究人员通过不懈的寻找，发现了一种名为R2的逆转录转座子，比起其他「垃圾」，R2家族可以将基因转入编码核糖体RNA (rRNA) 的区域，由于核糖体在细胞中起到的关键作用，在对应区域往往有数百个编码rRNA的基因拷贝。向这个区域内转入基因只会导致几个拷贝的失活，对核糖体的功能并不会带来显著的影响。换句话说，rRNA区域是转基因应用的「安全港」。
虽然人类有R2的插入位点，但人类在演化过程中丢失了R2。研究人员不得不在昆虫、螃蟹等低等动物中找寻最适合用于转基因操作的R2。功夫不负有心人，在经历过大量的筛选工作后，研究人员在斑胸草雀（Zebra Finch）与白喉带鸭 （White-throated sparrow）找到科学家梦寐以求的R2。
与此前被报道能够实现靶向启动逆转录（target-primed reverse transcription，TPRT）的桑蚕（BoMo）R2相比，研究人员在鸟类中找到的TaGu R2与ZoAl R2更为「专一」。BoMo R2几乎可以在任何RNA模版中实现TPRT，而TaGu R2与ZoAl R2仅能在存在特定序列的情况下才会发生TPRT。进一步试验证明，TaGu R2与ZoAl R2所用的RNA模版的3’端需要与rRNA中四个核酸互补(R4)，才能够实现TPRT, 意味着TaGu R2与ZoAl R2有着更好的特异性。在R4后的第22个核酸处引入腺苷（A22）能显著提高TPRT的效率。将引物区R4序列颠倒捣乱能完全破坏TaGu R2与ZoAl R2的TPRT功能，意味着与rRNA互补的R4对于TaGu R2与ZoAl R2实现TPRT至关重要。R4的存在给TaGu R2与ZoAl R2带来了极高的特异性。
鸟类R2实现转基因
在确定了TaGu R2与ZoAl R2的体外功能与特异性后，研究人员直接构建了能引入荧光蛋白的RNA模版，并与R2蛋白的mRNA进行了共转染。结果显示，在人源细胞中，该系统激发了极高的GFP表达，部分条件下超过了10%。在模版的3’ UTR序列加入A22能显著提高转基因效率，但将互补序列延长到20个碱基在效率上并没有明显的收益。
图片来源：Nature Biotechnology
在临床使用中，为了降低外源RNA的免疫原性，往往需要对尿苷进行额外的修饰，研究人员随后探究了这些修饰是否会影响该体系的效率。结果显示，使用修饰后的尿苷也能够实现转基因，其中假尿嘧啶核苷修饰能够提供最高的转基因效率。进一步实验则证明，该系统可以往人类细胞中转入TERT这类疾病相关的基因，并成功表现出了端粒酶活性。
这些数据证明基于TaGu R2与ZoAl R2的双RNA转基因系统，能够转入高达4.5kb的RNA模版，并具备巨大的基因治疗潜力。
更上一层楼
虽然TaGu R2与ZoAl R2表现不俗，但研究人员发现由它们转入的基因在细胞中的表达快速下降。以GFP为例，在转入一天内，GFP表达逐渐增加到峰值，随后便开始逐步下降。为了提高转基因的稳定性，研究人员针对ZoAl R2构建了多个变体，并得到了具有更低核酸内切酶活性的ZoAl-R1103A，将其命名为ZoAl-ENT。
图片来源：Nature Biotechnology
尽管ZoAl-ENT转基因效率显著低于野生型，但其在稳定性上表现出了极大的优势，在20天后依旧能维持6%左右的GFP表达，而野生型的ZoAl虽然在开始的几天能够达到更高的GFP表达，但在五天之后表现就不及ZoAl-ENT，并快速降低到1%左右。ZoAl-ENT能够往细胞中引入更稳定的基因表达，在rRNA序列引入的拷贝数在1到7个拷贝之间。这些数据表明通过对ZoAl R2的改造，能够实现的稳定的转基因。
图片来源：Nature Biotechnology
在研究的最后，研究团队探究了TaGu R2与ZoAl R2的特异性。结果显示，绝大多数的切口位置与预期相符，插入基因可以实现「无缝衔接」，仅有1%的插入偏离了1个碱基，发生在-1位置。研究人员也发现这种插入存在四种可能「工作模式」。在特异性方面，TaGu R2约有1%的脱靶插入，而ZoAl R2仅有0.1%。对于人体使用而言，PRINT技术还有进一步提升的空间。
尽管人们对R2蛋白依旧知之甚少，其具体的机制还需要更多的研究。PRINT的技术的出现，初步证实了R2用于基因治疗的巨大潜力，进一步丰富了人类的转基因工具库。相信在不久的将来，基于RNA的转基因技术会获得更大的成功。
本文原文来自PharmCube