克氏综合征男性不育新突破！北大团队Nature发文！
克氏综合征男性不育新突破！北大团队Nature发文！
克氏综合征是男性不育的常见遗传学病因之一，患者表现为较正常男性多一条X染色体。北京大学第三医院乔杰/袁鹏/闫丽盈/魏瑗团队在Nature发表最新研究，揭示了额外X染色体对胎儿生殖细胞发育的影响机制，并提出了潜在的治疗策略。
10月30日，北京大学第三医院妇产科乔杰/袁鹏/闫丽盈/魏瑗团队合作在《自然》（Nature）发表了题为“How the extra X chromosome impairs the development of male fetal germ cells”的研究文章。
研究以导致男性不育最常见的性染色体疾病——克氏综合征（核型47，XXY）为研究模型，系统揭示了额外的X染色体导致男性胎儿生殖细胞（Fetal germ cell，FGC）发育异常的分子机制，并且发现了改善该类患者生殖障碍的潜在干预策略，为其不育症的早期治疗提供了理论依据。
本研究主要作者
另辟蹊径，从胎儿阶段开始思考
生殖细胞的正常发育是维持生育力的根本，北京大学第三医院的乔杰院士团队一直致力于生殖细胞发育调控机制研究。团队的前期工作系统解析了人类生殖细胞从胎儿到成人各阶段的发育特征和调控机制。女性FGC（核型46，XX）中X染色体重新激活导致其X连锁基因的表达剂量显著高于男性（核型46，XY），而男性FGC中的X连锁基因表达剂量不仅低于女性FGC，还低于男性自身的性腺体细胞，提示不同类型的细胞对X连锁基因表达剂量的需求存在差异。
X连锁基因的表达剂量如何调控FGC发育，尤其是当X连锁基因表达剂量异常时如何影响FGC发育，尚不清楚，克氏综合征是研究这一重要科学问题的天然模型。患者核型为47，XXY，较正常男性多一条X染色体，发病率约为1/600，是导致男性不育最常见的遗传学病因之一。克氏综合征患者生殖细胞在青春期前就大量丢失，成年后主要表现为无精子症，伴随着曲细精管纤维化和透明化等睾丸组织病理改变。患者可以通过睾丸显微取精术获得后代，却仍有近一半的患者无法获得可用的精子。
既往研究通常聚焦于已经发生了生殖细胞大量丢失的成年克氏综合征患者，主要揭示了性腺内体细胞的发育异常。但这些体细胞的异常是否与生殖细胞丢失有直接关系尚无定论，相关分子机制一直未被揭示。
团队将目光转向胎儿阶段——袁鹏副研究员说，“克氏综合征患者胎儿期的生殖细胞可能已经出现X染色体剂量异常，并可能是其生殖障碍的分子基础，因此，研究胎儿期的生殖细胞可能是发现发育异常的关键，我们对此开展了深入研究。”
X染色体：胎儿生殖细胞中不失活
为了平衡女性和男性的性染色体表达剂量，女性两条X染色体会随机失活一条。XIST分子在其中起到关键作用。秦萌博士介绍说，“X染色体剂量异常往往和生殖障碍类疾病相关，比如克氏综合征和先天性卵巢发育不全的Turner综合征等。”
为了了解生殖细胞中X染色体的活性状态，需要实现生殖细胞标志、X染色体失活相关 RNA分子以及X染色体的共同定位。团队开发了蛋白/RNA/DNA三重荧光原位检测技术，成功解决了这一难题。团队发现克氏综合征早期FGC中XIST分子的分布是非常独特的，并将其命名为“星云状（nebular cloud）”分布，其分布面积大，高度紧密，且荧光强度很高。如何精确的去描述其分子分布状态成为另一个问题。秦萌博士介绍说，“我们基于图像分析技术开发了专用软件，从图像维度对相关特征（比如荧光强度、荧光信号最小外接圆的面积）进行精确统计，并构建了一种空间统计学计算模型，最终成功实现了对生殖细胞多种XIST分布状态的精准分类。”
△蛋白/RNA/DNA三重荧光原位检测技术和空间统计学算法
卢永杰博士介绍说，“令人意外的是，克氏综合征患者FGC中强烈的星云状XIST分布并没有导致X染色体失活。此外，我们发现正常女性（46，XX）以及超雌综合征（47，XXX）患者的FGC也不发生X染色体失活。因此，我们提出人类FGC中X染色体重新激活后不再失活。其中，XIST无法结合到X染色体以及XACT对XIST的拮抗作用可能是FGC中X染色体未失活的原因”。
然而，克氏综合征患者FGC中X染色体不失活会如何影响其发育呢？
不改变细胞的命运，却造成发育阻滞和迁移受损
研究发现，在克氏综合征胎儿性腺中，额外的X染色体并不会改变各种细胞的细胞命运，其细胞类型与正常男性性腺相同。团队发现，克氏综合征患者的FGC大多数（约81%）停留在早期阶段（正常男性对照中这一比例仅为15%），其FGC总数与正常男性对照相比没有显著差异，提示克氏综合征患者的FGC发生了严重的发育阻滞，但此时生殖细胞尚未出现明显丢失。团队进一步揭示了额外X染色体导致上述异常的机制：克氏综合征患者FGC中两条X染色体都处于活跃状态，X连锁基因的表达剂量远高于正常男性，导致WNT和TGF-β等通路活性上调，细胞周期过度活跃，阻碍其顺利进入有丝分裂静止阶段（晚期阶段），最终导致FGC发育阻滞。
除了发育阻滞，克氏综合征FGC另外一个关键异常是迁移受损。FGC的发育受到周围体细胞的精确调控，睾丸索中的支持细胞介导了FGC的迁移。妊娠中晚期需要从睾丸索中心迁移到基底部，进一步分化为精原干细胞，从而形成出生后男性的“生精池”。
研究发现克氏综合征胎儿支持细胞也出现发育异常，且与细胞迁移和运动相关的基因下调，导致支持细胞-FGC间参与细胞迁移的SEMA7A-ITGB1、CDH2-CDH2、JAM2-JAM3互作减弱，最终引起晚期FGC和支持细胞向睾丸索基底部的迁移受损。无法正常迁移的FGC将因为无法分化为精原细胞而死亡。
克氏综合征患者FGC中关键基因启动子的甲基化异常也可能是其发育阻滞的原因。DNA甲基化分析结果还提示，克氏综合征早期FGC的全基因组（包括印记基因）甲基化水平降低，而重复元件SVA的甲基化水平升高，这些表观遗传异常的意义有待进一步研究。
△克氏综合征患者FGC发育异常机制示意图
挽救FGC的发育阻滞
闫丽盈教授和魏瑗教授提出，“作为国家妇产疾病临床医学研究中心及国内顶尖辅助生殖中心，我们承担了科研创新、技术创新、疑难疾病诊疗攻关等一系列重要角色。我们不能止步于仅仅揭示克氏综合征患者生殖细胞发育障碍的机制，还要探索疾病的潜在治疗措施。” 因此，团队利用性腺体外培养体系，进一步探索了挽救克氏综合征FGC发育异常的可能策略。性腺组织体外的成功培养需要严苛的条件，且每次培养周期长达一个多月，经过半年多的摸索，终于实现了性腺组织的体外稳定培养。团队发现，在相同培养条件下，正常男性的FGC在体外能够有效分化，但克氏综合征患者的FGC无法继续分化。通过应用各种小分子化合物尝试改善性腺发育，团队最终发现TGF-β抑制剂能够显著改善克氏综合征患者FGC的分化，这为治疗克氏综合征患者生殖障碍提供了重要线索。
北京大学第三医院乔杰院士表示，“本研究不仅揭示了X染色体剂量异常影响克氏综合征胎儿生殖细胞发育的潜在机制，也丰富了对正常胎儿生殖细胞发育基本规律的理解，最为关键的是还提出了治疗克氏综合征无精子症的潜在新策略。此成果的发表，不仅得益于团队在生殖发育领域长期的研究积淀，更离不开青年科研人才不断探索、勇攀高峰的精神和闯劲。我们将继续深入探究生殖细胞发育的生理和病理机制，为生殖障碍相关疾病的诊断与治疗持续贡献北大力量。”
北京大学第三医院乔杰教授、袁鹏副研究员、闫丽盈教授、魏瑗教授为该论文的共同通讯作者，卢永杰博士后、秦萌博士、贺麒龙博士后、花凌月博士和齐心童博士为共同第一作者。该研究获得国家自然科学基金、国家重点研发计划、中国科协青年人才托举工程以及北京大学第三医院临床队列建设项目资助。
研究团队成员