原发性硬化性胆管炎肝脏免疫单细胞时空景观

原发性硬化性胆管炎肝脏免疫单细胞时空景观

原发性硬化性胆管炎（PSC）是一种罕见的慢性胆汁淤积性肝病，其特征是胆管炎症、纤维化和狭窄，最终可导致肝硬化和肝功能衰竭。目前，PSC的发病机制尚不完全清楚，缺乏有效的治疗方法。近年来，单细胞测序技术的发展为研究PSC的细胞异质性和疾病机制提供了新的视角。

2024年，来自加拿大多伦多综合研究所的科学家们在Journal of Hepatology上发表一篇题为“Single-cell and spatial transcriptomics characterisation of the immunological landscape in the healthy and PSC human liver”的文章，该研究通过单细胞转录组测序(scRNA-seq)揭示了健康(NDD)肝脏中额外的巨噬细胞多样性，展示了原发性硬化性胆管炎(PSC) 肝脏的综合图谱。该图谱有可能扩大我们对PSC细胞复杂性的理解，并为新的治疗方法开发提供信息。

研究背景

PSC是一种免疫介导的胆汁淤积性肝病，其特征是胆汁潴留、胆道树破坏和进行性纤维化，可导致终末期肝病和肝脏移植。目前尚无满足的需求来了解PSC肝脏的细胞组成及其如何影响疾病发病机制。作者生成了PSC肝脏与原发性胆汁性胆管炎(PBC)的综合图谱，并使用多种多组学模式和功能验证，参考健康肝脏数据集进行了比较。

研究结果

1. 全球NDD肝脏图谱

为了生成适合识别PSC异常转录组模式的扩展参考单细胞肝脏图谱，从来自24个不同NDD肝脏的100,000多个单细胞中收集了单细胞转录组，这些单细胞在广泛的年龄范围内具有相同的男性和女性代表性(图1)。将样本整合到单个图谱中，该图谱被聚类为20个细胞大类。(图1G)使用成分分析，发现不同样品的细胞类型存在显著差异(图1F)。

图1 NDD人肝脏的100k单细胞图谱揭示了供体之间的保守细胞类型

2. 扩展的NDD肝脏图谱阐明了人类巨噬细胞的多样性

最初的肝脏图谱基于五个NDD肝脏，能够区分两个不同的巨噬细胞群，其特征是与炎症的相反关系。然而，在疾病数据集中观察到巨噬细胞的多样性更大。为了确定这些巨噬细胞亚型是否存在于未患病的NDD肝脏中，对巨噬细胞群进行了亚聚类。亚聚类揭示了扩展图谱的11,127个巨噬细胞中的额外巨噬细胞多样性(图2 A)。在图谱中的巨噬细胞中鉴定了15个亚群，其中几个亚群在炎症或已知的非炎症标记物中表现出不同的表达。合并后，非炎症性Kupffer细胞和炎性单核细胞来源的巨噬细胞占NDD肝脏中所有巨噬细胞的40%。其余60%分布在8种罕见的表型中，包括LYVE1、FOLR2、TIMD4非炎症常驻巨噬细胞和VSIG4巨噬细胞。鉴于MHCIIhighVSIG4巨噬细胞与在许多小鼠组织中观察到的巨噬细胞相似，并在23/24 NDD肝脏和所有PSC/PBC肝脏以及已发表的NAFLD/ALD肝脏数据中发现(图 2)。

图2 通过扩展的NDD肝脏图谱揭示巨噬细胞多样性

3. 细胞间通讯检查表明内皮细胞可能参与PSC中髓样细胞的募集

先前研究显示，肝窦内皮细胞(LSEC)在肝脏中募集单核细胞至关重要。在NDD人肝中发现了大量巨噬细胞和LSEC之间的双联体，它们表达特定标志物。使用scmap，确定了双峰的细胞亚簇分配(图2E)。其中，最常见的成对相互作用是 Kupffer 细胞和中心静脉LSEC(cvLSEC)之间的相互作用。在PSC样品中也观察到少量这些双峰(图3A)。免疫荧光染色证实了内皮细胞(CD36)和Kupffer(C1QC)细胞在NDD肝脏中蛋白质水平的共定位(图2F)。

4. 空间转录组学识别巨噬细胞种群的空间位置

为了增加单细胞图谱的空间维度，使用空间转录组学对四个连续的z堆栈切片进行了测序(图2C,D)。肝细胞分区被捕获为每个切片中的第一或第二主要成分。通过检查巨噬细胞亚群，发现MHCII、LAM样巨噬细胞和Kupffer细胞略微位于中心周围，而活化的巨噬细胞位于门静脉周围(图2D)。

图3 胆道疾病中的肝细胞转分化

5. 胆管细胞样肝细胞在肝病中富集

从10例PSC患者和3例原发性胆汁性胆管炎PBC患者的移植肝脏中收集了5'scRNA-seq(图3)和 3'snRNA-seq(图 4)数据。为了给来自PSC和PBC肝脏的3' snRNA-seq数据提供NDD参考，合并了来自之前发表的NDD图谱。正如之前所观察，snRNA-seq很难捕获免疫细胞群，但观察到大量的肝细胞、胆管细胞和内皮细胞(图3A)。与NDD肝脏相比，PBC和PSC样品含有较少的门静脉周围肝细胞，活化的星状细胞数量更多，胆管细胞数量增加(图3C)。与NDD对照相比，许多胆管细胞相关基因，包括KRT7、BICC1、FGF13和DCDC2，在该肝细胞群的PBC和PSC中均上调(图3B)。这些发现表明，向胆管细胞样表型的转变是多种形式的肝硬化中疾病相关肝细胞的共同特征。

图4 scRNA-seq揭示了PSC和PBC的免疫复杂性

6. 在瘢痕区域内发现免疫扩增

从NDD图谱的6个肝脏的24,007个细胞中创建了一个5'scRNA-seq图谱，使用5'技术进行测序，来自8个PSC肝脏的44,150个细胞和来自2个PBC肝脏的17,230个细胞(图4A)。排除了3'scRNA-seq NDD样本，以避免与5'scRNA-seq患病肝脏的比较产生偏倚。虽然肝细胞、星状细胞和胆管细胞在单核图谱中有很好的代表性，但淋巴细胞群很难区分。相比之下，单细胞图谱揭示了浆细胞样细胞和常规树突状细胞的存在，以及大量淋巴细胞群，包括许多在NDD图谱中不存在的淋巴细胞群(图4A)。将这些细胞群与最相似的NK和T细胞进行比较，发现CD8T-cNK细胞群下调了促炎CCL3和上调的抗炎KLF2。相反，CD3T-lrNK群体上调促炎细胞因子CCL5和IL23，以及TRDV1和 TRGV3，表明这些可能是gdT细胞。

为了检查与炎症相关的细胞-细胞信号转导，作者检查了KEGG细胞因子通路基因对的表达。在PSC和 PBC 的纤维化区域发现了CCR7 CD4 T细胞与CCL19星状或 CCL21 ppLSEC细胞之间相互作用的证据(图4C)。CCL19、CCL21和IL7R(CD4 T细胞)的共定位在空间转录组学的多个重复中得到了证实(图5C-D)。使用Nanostring，观察到CD4 T细胞、星状细胞、ppLSECs和成熟B细胞在PSC中的共定位。然而，这仅适用于所检查的晚期患病区域。

7. PSC肝脏中的巨噬细胞功能障碍

与上调PSC炎症通路的淋巴细胞群不同，巨噬细胞在 PSC 中表现出抑制性信号分子(包括KLF2)的表达增加、OTULINL和IL27RA。IL27RA已被证明可以抑制巨噬细胞中细胞因子的产生，并且在PSC Kupffer细胞以及PSC和PBC LAM样巨噬细胞中上调。OTULINL 是巨噬细胞活化的有效负调节因子，缺乏会导致自身免疫性疾病，可以通过抗 TNF 治疗来挽救。作者观察到PSC和PBC肝脏中所有巨噬细胞群中的OTULINL显著上调。使用空间转录组学数据证实了单核细胞样巨噬细胞的这种瘢痕相关表型，这表明这些细胞在含有同心导管周围纤维化的纤维化区域中心的胆管细胞周围富集(图 5A,B)。

图5 PSC(纤维化区域)中免疫细胞的富集

原发性患者巨噬细胞的流式细胞术显示，PSC中CD68细胞相对于CD45(PTPRC)细胞显著消耗，这通过我们的单细胞数据的计算机门控得到证实(图6A-C)。此外，如前所述PSC，与NDD相比，观察到PSC中CD206巨噬细胞的百分比增加(图6D-E)。细胞内细胞因子染色 (ICS) 刺激试验表明，与 NDD 和 PBC 巨噬细胞相比，PSC巨噬细胞响应LPS和IFNɣ刺激分泌TNFα的能力显着降低(图6F-G)。

图6 PSC巨噬细胞的细胞因子分泌功能失调

结论

了解PSC细胞生态系统的主要挑战是缺乏具有单细胞分辨率的PSC肝脏中实质和非实质细胞的综合图谱。先前对PSC细胞景观的转录组学研究已在肝组织上采用bulk RNA-seq和对分选的免疫细胞群进行scRNA-seq并揭示了PSC免疫生物学的重要方面。这些研究确定了TH17细胞和B细胞在PSC发病机制中的潜在参与，并发现不同的导管和纤维化相关特征。综上所述，这些工作表明存在复杂的细胞相互作用驱动PSC疾病，为作者深入研究PSC肝脏中的实质和非实质细胞群提供了理论依据。

参考文献
Single-cell and spatial transcriptomics characterisation of the immunological landscape in the healthy and PSC human liver, Journal of Hepatology (2024), doi: https://doi.org/10.1016/j.jhep.2023.12.023.