革兰氏染色实验：原理、步骤与注意事项详解

革兰氏染色实验：原理、步骤与注意事项详解

革兰氏染色（Gram Staining）是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，由丹麦医生汉斯·克里斯蒂安·革兰于1884年创立。该方法通过特定的染色步骤，将细菌分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，对临床诊断及治疗具有重要意义。

原理

革兰氏染色的原理主要基于细菌细胞壁结构的差异。细菌细胞壁主要由肽聚糖层构成，但革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁结构存在显著差异：

• 革兰氏阳性菌：细胞壁较厚（20-80nm），肽聚糖层多达50层，且交联致密。此外，部分革兰氏阳性菌还含有磷壁酸，这些成分使得细菌在染色过程中能牢固地保留结晶紫与碘的复合物，不易被脱色剂洗脱，因此染色后呈紫色。

• 革兰氏阴性菌：细胞壁较薄（15-20nm），且外膜层类脂含量高，肽聚糖层薄且交联度差。在染色过程中，类脂为主的外膜容易溶解，使得结晶紫与碘的复合物无法被牢固保留，容易被脱色剂洗脱。随后，经过红色染料复染，革兰氏阴性菌呈现红色。

材料与仪器

实验试剂

• 无水乙醇
• 二甲苯
• 革兰氏染色试剂盒
• 中性树胶

实验仪器

• LEiCA TP-1020脱水机
• LEiCA HistoCore MULTICUT病理切片机
• 包埋机
• 冻台
• 组织摊片机
• 烤箱
• 载玻片
• 盖玻片
• OLYMPUS CKX43-LP显微镜
• 3DHISTECHP250FLASH全景扫描仪

实验步骤

1. 石蜡切片脱蜡至水：
   依次将石蜡切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min--无水乙醇Ⅰ3min-无水乙醇Ⅱ3min-90%酒精3min-80%酒精3min--70%酒精3min蒸馏水洗。

2. 胭脂红染色：
   胭脂红染色液滴染5min,倾去染液。

3. 分化：
   酸性乙醇分化液分化2-5秒，而后流水冲洗3-5秒。

4. 草酸铵结晶紫染色：
   草酸铵结晶紫染色液滴染5min,倾去染液，用滤纸吸干组织周围剩余染液。

5. Weigert碘液处理：
   weigert碘液处理1分钟，倾去碘液，用滤纸反复吸干切片内的水分。

6. 分化：
   用苯胺二甲苯分化至切片无紫色脱出，立即用二甲苯洗涤。

7. 洗涤封片：
   滴入新的二甲苯反复洗涤多次，彻底把苯胺洗去，中性树胶封片。

实验结果示例

• 革兰氏阳性细菌------蓝紫色
• 革兰氏阴性细菌-----粉红色
• 细胞核------红色

注意事项

1. 媒染时间：
   媒染时间应严格控制，避免过长或过短。媒染时间过长可能导致假阳性结果，而媒染时间过短则可能影响染色效果。

2. 脱色时间：
   脱色时间也是影响染色结果的关键因素。脱色时间过短可能导致阴性菌脱色不完全，出现假阳性；脱色时间过长则可能破坏阳性菌的细胞壁，导致假阴性结果。因此，脱色时间应严格控制在20-30秒。