免疫细胞家族：单细胞水平下的中性粒细胞

免疫细胞家族：单细胞水平下的中性粒细胞

中性粒细胞是天然免疫系统的重要组成部分，在人体免疫防御中发挥着关键作用。近年来，随着单细胞测序技术的发展，研究人员能够以更高的分辨率解析中性粒细胞的异质性和功能状态。本文将介绍中性粒细胞的生物学特性及其在人体中的重要作用，并总结近年来单细胞测序在中性粒细胞研究中的重要进展。

图1 中性粒细胞

中性粒细胞的生物学特性

中性粒细胞是循环白细胞中数量最多的细胞类型，作为宿主抵御入侵细菌等病原体的一道防线。在急性炎症期间，中性粒细胞是主要的反应者之一，在感染部位发挥重要作用。当血液中的中性粒细胞绝对减少时，会导致严重的免疫缺陷。

除了在免疫防御中的作用，中性粒细胞还参与人体多种正常功能。研究发现，在健康人群中，肺部的中性粒细胞能够促进血管的形成，而皮肤中的中性粒细胞有助于保持皮肤上皮的完整性。在癌症中，肿瘤相关中性粒细胞（TANs）已成为肿瘤微环境的重要组成部分。TANs可通过驱动血管生成、细胞外基质重构、转移和免疫抑制成为肿瘤促进炎症反应的一部分。另外，中性粒细胞也可通过直接杀死肿瘤细胞和参与介导抗肿瘤抵抗的细胞网络来介导抗肿瘤反应。因此，中性粒细胞可能成为未来肿瘤等疾病治疗的重要靶标。

单细胞测序在中性粒细胞研究中的挑战

在单细胞研究中，中性粒细胞的主要挑战有：一方面中性粒细胞的基因表达水平比较低；另一方面，中性粒细胞较为敏感，半衰期比较短，对于实验操作方面也有着非常高的要求。因此，中性粒细胞的单细胞测序具有一定的挑战。

单细胞测序在中性粒细胞上的研究进展

单细胞测序揭示不同环境下的中性粒细胞异质性

2020年发表在Nature Immunology上的“Single-cell transcriptome profiling reveals neutrophil heterogeneity in homeostasis and infection”一文使用单细胞尺度系统性地描绘了中性粒细胞在稳态和炎症状态下成熟、分化和命运决定过程中的异质性群体和转录组动态变化[1]。

图2 单细胞测序中稳态环境下骨髓、外周血、脾脏来源的中性粒细胞

• 样本信息：用FACS分选小鼠骨髓、外周血、脾脏中的Gr1+细胞(作者额外准备了个样本做批次效应校准：c-Kit+骨髓造血干细胞：BM Gr1+细胞=2:3混入)；
• 研究背景：单细胞测序是探索免疫细胞异质性的有力工具，作者采用一种无偏倚、系统的方法，在单细胞分辨率下解剖骨髓、外周血和脾脏中的小鼠中性粒细胞群体。
• 研究结论：在已知和未表征的转录因子的驱动下，中性粒细胞逐渐获得杀死微生物的能力，代表了一种有效但平衡的中性粒细胞反应的进化机制。细菌感染对中性粒细胞群的遗传结构进行重新编程，改变亚群之间的动态转变，并在不影响整体异质性的情况下启动中性粒细胞以增强功能。总之，这些数据为在单细胞分辨率下研究中性粒细胞相关疾病机制、生物标志物和治疗靶点建立了参考模型和一般框架。

揭示肝癌免疫微环境亚型和中性粒细胞异质性

2022年Nature杂志在线发表题为“Liver tumor immune microenvironment subtypes and neutrophil heterogeneity”的研究论文，这项研究分析了189个肝癌患者和小鼠模型样本的细胞景观，解剖了TIME亚型，从而揭示了肝癌免疫微环境亚型和中性粒细胞异质性[2]。

图3 中性粒细胞的异质性和耗竭的小鼠模型

• 样本信息：124名肝癌患者和8只肝癌小鼠的189份样本；
• 研究背景：原发性肝癌(primary liver cancer, PLC)有三种主要的组织学亚型-肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)，肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)和肝细胞和肝内胆管癌合并(combined hepatocellular and intrahepatic cholangiocarcinoma, CHC)。尽管免疫治疗最近取得了进展，但我们对PLC的肿瘤免疫微环境了解非常有限；
• 研究结论：总的来说，这项研究描绘了PLC的全面细胞景观，使我们能够识别五种TIMELASER亚型并解码中性粒细胞异质性。TIMELASER框架覆盖了大多数细胞群，并提供了显示空间分辨率的基线TIME亚型的无偏分层。进一步探索中性粒细胞对免疫治疗的影响以及相关的混杂临床因素将为更好地理解TAN生物学提供新的机会，并提出肝癌治疗的转化研究路径。

揭示急性肺损伤中性粒细胞的表型转化及其潜在调控机制

2022年Nature Communications在线发表了题为“Locally organised and activated Fth1hi neutrophils aggravate inflammation of acute lung injury in an IL-10-dependent manner”的研究论文，该团队在ALI小鼠肺部鉴定出两组在转录、分布和功能存在明显异质性的中性粒细胞亚群，并且揭示了这两种亚型在ALI病理过程中的不同作用及在ARDS患者肺部的比例变化[3]。

图4 ALI小鼠肺部中性粒细胞不同亚型的位置分布

• 样本信息：ALI(急性肺损伤)小鼠肺组织/ARDS(急性呼吸窘迫综合征)患者肺部；
• 研究背景：急性肺损伤(acute lung injury，ALI)及其更为严重阶段的急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是严重威胁人类健康的呼吸系统危重症。中性粒细胞作为肺部最重要的固有免疫细胞之一，在其发生发展中起着非常关键的驱动作用；
• 研究结论：在ALI小鼠肺部鉴定出两组在转录、分布和功能存在明显异质性的中性粒细胞亚群，并且揭示了这两种亚型在ALI病理过程中的不同作用及在ARDS患者肺部的比例变化。该结论为ALI/ARDS发生发展过程中，肺部中性粒细胞表型变化填补了空白，为该病过激炎症反应的精准化调控提供了理论依据，同时亦为ARDS患者的预后评估提供了新的生物标志物。

中性粒细胞在胰腺癌进展中的重要作用

2022年Gut(IF=23)在线发表题为“Single-cell RNA-seq analysis reveals BHLHE40-driven pro-tumour neutrophils with hyperactivated glycolysis in pancreatic tumour microenvironment ”的研究论文，该研究分析了来自5名PDAC患者的外周血多形核白细胞(PMN)和肿瘤浸润免疫细胞的单细胞转录组，并进行了免疫荧光/免疫组织化学染色、多组学分析和体外实验，以验证生物信息学分析的发现[4]。

图5 PDAC微环境中嗜中性粒细胞和其他细胞之间的细胞-细胞通信

• 样本信息：5名PDAC患者的外周血多形核白细胞(PMN)和肿瘤浸润免疫细胞；
• 研究背景：胰腺癌主要由胰腺导管腺癌(PDAC)组成，是最致命的恶性肿瘤之一，也是癌症相关死亡的主要原因之一，其5年生存率低至9%。先天免疫在PDAC作为非T细胞富集的肿瘤中起重要作用。中性粒细胞是先天免疫系统的主要参与者。该研究旨在探索PDAC中中性粒细胞的异质性和促肿瘤机制。
• 研究结论：通过转录组学、蛋白质组学和代谢组学分析的综合多组学方法验证了TAN的糖酵解转换。通过LDHA过表达激活糖酵解活性诱导中性粒细胞样分化的HL-60(dHL-60)细胞的免疫抑制和促肿瘤功能。

晚期非小细胞肺癌肿瘤及免疫微环境异质性解析

2021年Nature Communications杂志在线发表了由上海肺科医院周彩存教授团队的晚期非小细胞肺癌单细胞研究的重要成果“Single-Cell Profiling of Tumor Heterogeneity and Its Microenvironment in Advanced Non-small Cell Lung Cancer”。该研究基于新格元GEXSCOPE®单细胞测序技术全面解析了42例晚期NSCLC病人的穿刺样本，分别从肿瘤细胞异质性、基质和免疫细胞表型、浸润以及相互作用微环境等多个方面全面表征了晚期NSCLC患者的疾病特征[5]。

图6 中性粒细胞和肿瘤亚型、ITH的关联性分析

• 样本信息：42例晚期NSCLC病人的穿刺样本；
• 研究背景：肺癌在全世界范围内，都是一种备受临床和科研关注的恶性肿瘤。在过去的十年中，晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗取得了长足发展，特别是免疫检查点抑制剂(ICIs)的开发和应用，使得晚期NSCLC的五年生存率得到了极大的提高。目前，无论是单药还是联合，PD-1或PD-L1抑制剂已经成为了NSCLC一线或二线治疗的标准方案。但免疫治疗并非万能，其在临床使用中仍存在很多的挑战。
• 研究结论：研究发现，不同患者来源的肿瘤在细胞组成、染色体结构、分化轨迹，以及胞间信号网络等方面都存在显著的异质性。该研究还发现了肿瘤异质性和肿瘤相关中性粒细胞之间的关联性，为中性粒在NSCLC中的功能研究和其在免疫治疗疗效中的潜在预测作用打开了新的视角。

参考文献

[1] Xie X, Shi Q, Wu P, et al. Single-cell transcriptome profiling reveals neutrophil heterogeneity in homeostasis and infection[J]. Nature immunology, 2020, 21(9): 1119-1133.

[2] Xue R, Zhang Q, Cao Q, et al. Liver tumour immune microenvironment subtypes and neutrophil heterogeneity[J]. Nature, 2022: 1-7.

[3] Wang K, Wang M, Liao X, et al. Locally organised and activated Fth1hi neutrophils aggravate inflammation of acute lung injury in an IL-10-dependent manner[J]. Nature Communications, 2022, 13(1): 7703.

[4] Wang L, Liu Y, Dai Y, et al. Single-cell RNA-seq analysis reveals BHLHE40-driven pro-tumour neutrophils with hyperactivated glycolysis in pancreatic tumour microenvironment[J]. Gut, 2022.

[5] Wu F, Fan J, He Y, et al. Single-cell profiling of tumor heterogeneity and the microenvironment in advanced non-small cell lung cancer[J]. Nature communications, 2021, 12(1): 2540.