BLAST比对工具详解：原理、使用方法及命令行操作

BLAST比对工具详解：原理、使用方法及命令行操作

引用

CSDN

1.

https://blog.csdn.net/Da_gan/article/details/146297252

BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）是一种广泛应用于生物信息学领域的序列比对工具，主要用于核酸或蛋白质序列的搜索与比对。其基于局部比对的启发式算法能够快速识别高相似度的序列区域，而无需进行全局比对。本文将详细介绍BLAST的基本原理、使用方法及其局限性。

BLAST的基本流程

BLAST的比对过程主要分为五个步骤：

1. 种子匹配（Seed Matching）
2. 种子扩展（Extension）
3. HSP筛选（High-scoring Segment Pairs, HSPs）
4. 统计评估（Scoring & Evaluation）
5. 结果输出（Output & Reporting）

详细比对原理

（1）种子匹配（Seed Matching）

BLAST使用k-mer（短字词）索引法快速寻找目标数据库中可能的匹配区域：

• 先将查询序列切割成多个k-mer（k-字母短词），默认k值：
• 蛋白序列：默认 k = 3（称为三肽）
• DNA序列：默认 k = 11
• 然后，将这些短词在数据库序列中寻找完全匹配或近似匹配的区域。
• 通过索引表（Hash Table）快速查找候选区域，避免直接进行全局比对。

👉 例子：

• 查询序列（蛋白）：MKTLLL
• k = 3，则生成短词：MKT, KTL, TLL, LLL
• 在数据库中查找是否存在这些短词的匹配项。

（2）种子扩展（Extension）

当找到匹配的种子序列（seed word）后，BLAST会尝试向两侧延伸，以获得更长的匹配区域：

• 采用动态规划方法（类似Smith-Waterman算法），在匹配点两侧扩展比对。
• 计算比对分数（alignment score）：
• 匹配（Match）：+得分
• 错配（Mismatch）：-罚分
• 空位（Gap）：-罚分
• 直到比对分数下降到一定阈值（低于“下降值” drop threshold），停止扩展。

👉 例子：

Query: ...MKTLLLSIV...
Database: ...MKTLLLSLV...

比对过程中：

MKTLLLSIV
MKTLLLSLV （仅S -> I 替换）

扩展过程在检测到替换（S -> I）后继续，但如果进一步错配过多，扩展会停止。

（3）HSP筛选（High-scoring Segment Pairs, HSPs）

• HSP（高得分片段对）是指具有较高匹配得分的局部比对区域。
• BLAST使用阈值（threshold）来过滤低质量比对：
• 仅保留高得分的HSP。
• HSP通常是比对结果的核心，BLAST会基于这些HSP进行进一步统计分析。

（4）统计评估（Scoring & Evaluation）

BLAST采用统计学方法评估比对的可靠性，主要计算：

1. Bit Score（比特分数）

比特分数用于比较不同BLAST运行之间的可比性：

• 计算公式：
• 其中：
• S：原始比对得分
• λ（Lambda）和 K：基于数据库和查询序列计算的参数

Bit Score越高，代表比对越可靠。

2. E-value（期望值）

E-value 表示随机匹配出现在数据库中的概率，计算公式：

其中：

• m：查询序列长度
• n：数据库中序列总长度
• λ（Lambda）和 K：校正参数
• S：比对得分

解释：

• E-value 越小，说明比对越可靠。
• 一般情况下，E < 1e-5（0.00001） 的比对结果被认为是显著的。

（5）结果输出（Output & Reporting）

BLAST最终输出：

1. 匹配序列ID
2. 比对得分（Bit Score）
3. E-value
4. HSP区域的比对细节
5. 查询序列与数据库序列的比对图示

BLAST的优化

（1）不同BLAST算法

BLAST 有多个变体：

（2）参数优化

用户可以通过调整word size（种子长度）、gap penalty（缺口罚分）等参数优化比对：

• 更小的word size（如BLASTN设为 7）提高灵敏度，适用于短序列比对。
• 调整gap penalty可以优化插入缺失（Indel）检测。

BLAST的局限性

虽然BLAST比对快速高效，但仍有局限：

1. 局部比对：不适用于全局比对，可能错过远端关系。
2. 对大数据的计算要求高：BLAST比对百万序列时计算量较大。
3. 对长序列不够精确：不适合基因组级别的长序列比对（推荐使用BWA、Bowtie等）。

总结

• BLAST基于启发式方法，先寻找短词匹配，再进行扩展比对，并通过统计方法评估显著性。
• 计算E-value 评估比对的可靠性，Bit Score 进行评分比较。
• 适用于DNA、RNA、蛋白等生物序列的比对，在基因注释、进化分析、功能预测等方面广泛应用。

BLAST比对的基本命令流程

BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）主要用于DNA、RNA 和蛋白质序列的比对，能够快速搜索数据库并找到相似序列。以下是BLAST比对的完整命令流程，包括安装、数据库构建、查询比对、结果解析等步骤。

1. 安装BLAST

如果你尚未安装BLAST，可以使用以下方法进行安装：

（1）Linux / macOS

使用conda或apt安装：

# 使用conda安装（推荐）
conda install -c bioconda blast
# Ubuntu/Debian系统
sudo apt update && sudo apt install ncbi-blast+  

（2）Windows

可以从NCBI官方网站下载：https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/

2. 准备数据库

BLAST比对需要一个数据库作为参考，通常可以选择：

• NCBI数据库（如nt、nr）
• 自定义序列数据库

（1）下载NCBI公共数据库

如果要比对核酸序列，可以使用nt（核酸库）：

如果要比对蛋白序列，可以使用nr（蛋白库）：

update_blastdb.pl --decompress nr

（2）自定义BLAST数据库

如果要比对自己的基因组或蛋白序列，需要先用makeblastdb创建数据库。

① 创建DNA数据库

假设你有一个参考基因组genome.fa，可以用以下命令创建BLAST数据库：

makeblastdb -in genome.fa -dbtype nucl -out genome_db

参数解析：

• -in genome.fa：输入的FASTA文件
• -dbtype nucl：指定数据库类型（核酸nucl或蛋白prot）
• -out genome_db：输出数据库名称

② 创建蛋白数据库

如果比对的是蛋白序列：

makeblastdb -in proteins.fasta -dbtype prot -out protein_db

3. 运行BLAST比对

BLAST提供多个程序，适用于不同类型的比对：

（1）DNA序列比对（blastn）

如果你的查询序列是DNA，需要比对到基因组，可以使用blastn：

blastn -query query.fa -db genome_db -out results.txt -evalue 1e-5 -outfmt 6 -num_threads 4

参数解析：

• -query query.fa：查询序列
• -db genome_db：参考数据库
• -evalue 1e-5：E-value阈值（值越小结果越可靠）
• -outfmt 6：输出格式（6表示表格格式）
• -num_threads 4：使用4个线程加速

示例输出（表格格式-outfmt 6）：

query1  scaffold_1   97.8   300 0   0   100 400 5000    5300    1e-50    200
query2  scaffold_2   95.6   250 3   1   50  300 8000    8250    2e-40    180

字段解析：

1. Query ID（查询序列名称）
2. Subject ID（比对的目标序列）
3. 相似度（% identity）
4. 比对长度（alignment length）
5. 错配数（mismatches）
6. 缺失数（gap openings）
7. Query起始位点
8. Query终止位点
9. Subject起始位点
10. Subject终止位点
11. E-value
12. Bit score

（2）蛋白序列比对（blastp）

如果要比对蛋白质序列（蛋白 vs 蛋白），使用blastp：

blastp -query query_protein.fa -db protein_db -out results.txt -evalue 1e-5 -outfmt 6 -num_threads 4

（3）DNA vs 蛋白比对（blastx）

如果你的查询序列是DNA但要比对蛋白数据库（先翻译再比对），使用blastx：

blastx -query query.fa -db protein_db -out results.txt -evalue 1e-5 -outfmt 6 -num_threads 4

这适用于预测基因编码区（CDS）的功能注释。

（4）蛋白 vs DNA比对（tblastn）

如果你的查询序列是蛋白，但目标数据库是DNA（将DNA翻译后比对），使用tblastn：

tblastn -query protein.fa -db genome_db -out results.txt -evalue 1e-5 -outfmt 6 -num_threads 4

这可以用于寻找基因组中的蛋白编码区。

（5）DNA vs DNA翻译比对（tblastx）

如果查询序列和数据库都是DNA，但希望都翻译为蛋白后再进行比对：

tblastx -query query.fa -db genome_db -out results.txt -evalue 1e-5 -outfmt 6 -num_threads 4

这种方法计算量较大，但可以检测远缘同源序列。

4. 结果筛选与分析

BLAST 结果通常需要进一步筛选：

（1）提取高质量比对结果

awk '$3 > 90 && $4 > 100' results.txt > filtered_results.txt

解释：

• $3 > 90：相似度 > 90%
• $4 > 100：比对长度 > 100 bp

（2）统计比对数量

wc -l results.txt

（3）可视化BLAST比对

可以用blast_formatter转换为HTML格式：

blastn -query query.fa -db genome_db -out results.html -evalue 1e-5 -outfmt 7

然后用浏览器打开results.html查看。

5. 总结

完整BLAST流程

1. 安装BLAST：

   conda install -c bioconda blast
   

2. 准备数据库

• 下载NCBI数据库：

  update_blastdb.pl --decompress nt
  

• 自建数据库：

  makeblastdb -in genome.fa -dbtype nucl -out genome_db
  

3. 运行BLAST比对：

   blastn -query query.fa -db genome_db -out results.txt -evalue 1e-5 -outfmt 6 -num_threads 4
   

4. 筛选结果：

   awk '$3 > 90 && $4 > 100' results.txt > filtered_results.txt