微生物菌种甘油保藏教程及操作要点
微生物菌种甘油保藏教程及操作要点
一、甘油保藏教程
01、准备阶段
配制甘油溶液：甘油原液较为粘稠，因此通常将其与水按一定比例混合，形成甘油水溶液。常用的比例为甘油与水1:1，即得到50%的甘油浓度。之后将配制好的甘油水溶液进行高压灭菌处理，以杀灭其中的杂菌，确保无菌状态。
准备菌种：选择需要保藏的微生物菌种，确保其纯度和活性。将菌种接种于适宜的液体培养基中，进行培养并制备成菌液。菌液的浓度越大，菌种保存时间通常越长。
02、混合阶段
菌液与甘油混合：在无菌条件下，将灭菌后的甘油水溶液与菌液按一定比例混合。通常，甘油与菌液的体积比为1:1，使甘油终浓度保持在20%~30%之间。这一比例范围有助于保持菌种的活性和稳定性。之后振荡密封的试管或保藏管，使菌悬液与甘油充分混匀。
03、保存阶段
冷冻保存：将混合好的甘油菌种转移至-20℃或-80℃的冰箱中进行长期冻存。一般来说，保藏温度越低，保藏效果越好。目前实验室大都采用-80℃冰箱进行保藏。需要注意的是，冷冻时应保持降温速率适中，推荐降温速率为1℃/min，避免过快或过慢对菌种造成损伤。
取用与复苏：需要取用菌种时，将冻存管从冰箱中取出，放入30℃水浴中快速解冻（注意，某些资料中提到用37℃水浴解冻，但30℃更为常用且安全，以避免高温对菌种活性的潜在影响）。解冻过程应迅速且避免反复冻融，以免影响菌种的活性。解冻后，用无菌接种环蘸取甘油菌悬液，接种到适宜的培养基上进行复苏和培养。
二、操作要点
选择合适的培养基：勿使用选择性培养基进行保藏，因为微生物在选择性培养基中生长时，某些生物特性可能会丢失。一般使用非选择性的增菌培养基进行保藏。
无菌操作：在整个保藏过程中，应严格遵守无菌操作规程，包括在无菌环境下进行菌种的接种、培养和甘油混合等操作，以防止杂菌污染。
定期检测：建议每半年进行一次菌种确认试验，通过平板划线分离、观察菌落形态、染色镜检等常规实验检测细菌的存活情况。若有条件，可用菌株生化鉴定试剂盒进行确认。
避免反复冻融：取用菌种后，应尽量避免对剩余的甘油菌种进行反复冻融操作，以免影响菌种的活性和稳定性。
记录保存信息：在保存甘油菌种时，应详细记录菌种的名称、保存日期、甘油浓度、保存温度等信息，以便后续取用和管理。