一抗、二抗怎么选？科研抗体使用全攻略
一抗、二抗怎么选？科研抗体使用全攻略
在科研实验中，抗体就像是一把“钥匙”，而一抗和二抗则是这把钥匙的两个部分：一抗负责识别目标，二抗负责放大信号。但如果选错了“钥匙”，实验可能会变成一场灾难：信号弱、背景高、甚至完全失败。
一抗选择：找到那把“对的钥匙”
一抗是实验的核心，它的选择直接决定了实验的成败。以下是选择一抗的四大关键点：
目标明确：你要检测什么？
蛋白质类型：全长蛋白、磷酸化蛋白、突变蛋白？
实验类型：WB、IF、IHC、流式？不同实验对一抗的要求不同。
物种匹配：确保一抗能识别目标物种的蛋白（如人、小鼠、大鼠）。
特异性：避免“认错人”
查看抗体的验证数据（如KO验证、质谱分析）
选择经过同行评议的抗体（引用文献多的通常更可靠）
灵敏度：信号够强吗？
高丰度蛋白：选择普通抗体即可
低丰度蛋白：选择高灵敏度抗体（如经过信号放大技术优化的抗体）
应用验证：适合你的实验吗？
查看抗体说明书中的应用验证数据。
优先选择经过你实验类型验证的抗体。
一抗选择的核心要素
目标蛋白特异性：确认抗体针对的是目标蛋白的特定表位。
种属反应性：根据实验样本来源选择匹配的抗体。
宿主物种：一抗宿主需与二抗匹配。
应用验证：查看抗体的验证数据。
单克隆 vs 多克隆
- 单克隆抗体：高特异性，批次稳定性强（适合定量实验）。
- 多克隆抗体：灵敏度高，可识别多个表位（适合低丰度靶标）。
二抗选择：放大信号的“助推器”
二抗的作用是放大一抗的信号，但它并非“万能插头”，选择时需要注意以下几点：
宿主匹配：一抗和二抗的“配对规则”
如果一抗是小鼠来源，二抗必须抗小鼠
常见组合：
一抗（兔） + 二抗（抗兔）
一抗（小鼠） + 二抗（抗小鼠）
一抗（山羊） + 二抗（抗山羊）
标记物选择：让信号“亮”起来
酶标二抗（如HRP、AP）：适合WB、ELISA
荧光二抗（如FITC、Cy3）：适合IF、 流式
生物素标记二抗：适合信号放大实验
交叉吸附：降低背景噪音
选择经过交叉吸附处理的二抗，避免与非目标物种的抗体结合。
[例如：抗兔二抗应经过小鼠、大鼠血清吸附处理]
稀释优化：找到最佳浓度
二抗通常需要1:1000到1:5000的稀释比例。
设置多浓度梯度预实验优化稀释倍数， 避免信号过强或过弱。
一抗和二抗的“黄金搭配”技巧
多重染色实验：避免信号重叠
选择不同宿主来源的一抗（如兔抗A蛋白+小鼠抗B蛋白）
搭配不同荧光标记的二抗（如抗兔-Cy3+抗小鼠-FITC）
弱信号实验：增强信号强度
选择高灵敏度二抗（如经过聚合物放大的HRP二抗）
使用信号放大系统（如TSA）
高背景实验：降低噪音
增加封闭时间（如用5% BSA封闭1小时）
优化洗涤步骤（如增加洗涤次数或延长洗涤时间）
常见问题与解决方案
信号弱或无信号
可能原因：一抗浓度过低、二抗不匹配、抗原表位被遮蔽。
解决方案：提高一抗浓度、更换二抗、尝试抗原修复。
背景高
可能原因：二抗浓度过高、封闭不充分、洗涤不彻底。
解决方案：降低二抗浓度、延长封闭时间、优化洗涤步骤。
非特异性条带
可能原因：一抗特异性差、样本降解、封闭不充分。
解决方案：验证一抗特异性、使用新鲜样本、更换合适的封闭液或延长封闭时间。
抗体使用的“黄金法则”
- 预实验优化：不要直接按说明书操作，先做预实验优化条件。
- 分装保存：避免反复冻融，分装后-20℃或-80℃保存。
- 记录批次：不同批次的抗体可能有差异，记录批次号以便追溯。
- 对照实验：设置阳性对照和阴性对照，确保实验可靠性。