PCR标准操作流程详解

PCR标准操作流程详解

聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外合成双链DNA的技术，广泛应用于生物医学、法医鉴定、环境监测等领域。本文将详细介绍PCR技术的标准操作流程，包括试剂准备、操作步骤、注意事项等核心内容，帮助读者更好地理解和掌握这一重要技术。

一、概述

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是一种在体外合成双链DNA的技术。其原理模仿了天然DNA的复制过程，通过特异引物和高特异性酶，确保反应的特异性。典型的PCR反应包括三个步骤：变性、退火和延伸，通过多次循环，最终获得目标DNA片段。

二、试剂准备

以下为进行PCR反应所需的试剂及其终浓度：

三、操作步骤

1. 配置反应体系
   将以下成分按顺序加入0.5ml的离心管中：

• 加入PCR buffer。
• 加入dNTPs。
• 加入Forward primer。
• 加入Reverse primer。
• 加入Template DNA。
• 加入热启动酶。
• 用ddH2O补至总体积50 ul。

注意：使用热启动酶时，可在常温下操作；非热启动型酶需在低温下配置反应体系。

2. 设置反应条件
   根据试剂盒说明书设置反应时间和温度，完成扩增后进行电泳鉴定。

3. 琼脂糖核酸电泳
   ① 准备电泳器具，用蒸馏水洗净并架好梳子。
   ② 根据所需分离的DNA片段大小，制备适当浓度的琼脂糖凝胶。
   ③ 将琼脂糖和电泳缓冲液（TAE或TBE）加入锥形瓶中，加热融化后冷却至40℃左右，混匀并倒入电泳槽。
   ④ 室温下凝固凝胶，拔出梳子，准备点样。
   ⑤ 在电泳槽中加入电泳缓冲液，确保覆盖凝胶表面。
   ⑥ 混合5ul样品、1ul的6xLoding buffer和1ul染料，缓缓注入点样孔，避免串孔。
   ⑦ 接通电源（红正黑负），设置电压40-60V，电泳时间30-40min，根据溴酚蓝的位置判断是否终止电泳。
   ⑧ 电泳结束后，关闭电源，进行凝胶成像观察，并对比marker确定片段大小。

不同琼脂糖浓度对应的DNA片段大小如下表：

四、注意事项

引物设计

• 引物应设计在cDNA的保守区域。
• 引物长度应在15-28bp之间。
• GC含量应在40%-60%之间。
• 避免引物自身形成发夹结构，完成后进行BLAST验证。

模板DNA

• 模板可以是单链或双链DNA。
• 不同来源的模板起始浓度有一定要求。
• 模板提取后应注意保存，避免降解。

其他

• 选择合适的Taq DNA聚合酶。
• 确保四种dNTP浓度相同。
• 操作过程中戴手套，保持环境干净，防止污染。
• PCR用水需经过高压灭菌或0.2um滤膜过滤。

五、常用试剂配方

电泳缓冲液

• 50xTAE（pH8.5）

• Tris 242g

• EDTA（Na）37.2g

• 加入800ml去离子水，搅拌溶解

• 加入57.1ml乙酸，调pH至8.5后定容至1L

• 10xTBE（pH8.3）

• Tris 108g

• EDTA 7.44g

• 硼酸55g

• 加入800ml去离子水，搅拌溶解，调pH至8.3后定容至1L

上样缓冲液（6xLoding buffer）

• 0.25%二甲苯青
• 0.25%溴酚蓝