流式死活染料全攻略：死活染料怎么染？流式染色结果如何解读？

流式死活染料全攻略：死活染料怎么染？流式染色结果如何解读？

流式细胞术是一种重要的生物医学研究技术，而死活染料的使用对于提高实验数据的准确性和可靠性至关重要。本文将详细介绍流式细胞术中死活染料的种类、检测原理、染色流程以及结果解读，帮助科研人员更好地掌握这一技术。

1. 为什么要使用死活染料？

样品中死细胞的存在会极大地影响流式检测效果，从而最终影响数据质量及真实性。这主要是因为：

• 死细胞具有非特异性染色
• 死细胞自发荧光特别强，导致背景荧光增强，使得我们无法观察到一些标记的弱阳性表达
• 死细胞还可能会释放DNA，DNA非常粘稠，会导致细胞成团，既影响结果，又容易堵塞管路

在常规操作中，离心、洗涤等步骤就会产生少量死细胞。如果样本本身就是一些细胞活性较差的来源，如非免疫类的组织制备的细胞悬液、病人或长时间放置的血液样本、体外培养的细胞样本等，细胞活性会更差。因此，在进行流式实验时，推荐搭配使用死活染料。

2. 死活染料的种类及检测原理

传统的流式细胞死活染料为细胞膜非通透性的核酸染料，例如PI、7-AAD、DAPI。这类核酸染料能穿过死细胞的细胞膜，结合核酸后发出荧光，而无法穿过活细胞的细胞膜。最后染，快速上机。

但是，如果实验涉及到胞内染色，细胞需要固定破膜，核酸染料会将所有的细胞都染上颜色，难以分辨死活信号。此时应选择可以固定的细胞死活染料，即Fixable viability dye，先染死活。

3. 死活染料的染色流程

核酸类死活染料染色流程：

1. 按常规流式染色流程，完成表面染色后
2. 在1×10^6细胞的100 µl细胞悬液中，加入适量核酸类死活染料，轻摇混匀

• 7-AAD（Cat. 556463）: 5 µl, 50 µg/ml
• PI（Cat. 556463）: 10 µl, 50 µg /ml
• DAPI（Cat. 564907）: 0.5~2 µl, 1 mg/ml
• 其他染料也请按照说明书推荐用量并结合预实验摸索最佳染料用量

3. 避光室温孵育5 min
4. 1 h内进行流式上机检测

胺基类死活染料染色流程：

1. 使用前，先将染料粉末，请根据说明书中的“Preparation”部分所写的体系，使用细胞培养级别的DMSO，对粉末在室温条件下，进行充分涡旋溶解
2. 使用不含叠氮化钠和不含蛋白质/血清的 Dulbecco 磷酸盐缓冲液(1X DPBS)，清洗细胞一次
3. 在无叠氮化钠和无蛋白质/血清的1X DPBS中以 1-10x10^6 个细胞/ml重悬细胞
4. 每 1 ml 细胞悬液 (1:1000) 加入 1 μl 溶解后的FVS死活染料，涡旋混匀

• 注意：我们建议滴定染料以获得最佳性能，因为不同的细胞类型和不同的应用可能会导致染色的可变性程度很大。

5. 推荐避光室温下孵育 1015 min（可选：37°C 孵育 57 min或 2-8°C 孵育 30~60 min）
6. 用 2 ml BD 的Stain Buffer（Cat. 554656）或替代物（如含1-2%血清的PBS等）洗涤离心收集细胞两次
7. 用Stain Buffer或替代物重悬细胞
8. 根据下游应用的需要，按常规流式染色流程对细胞进行FCR阻断、表面染色、固定破膜及胞内染色等

4. 荧光搭配的选择

死活染料之间的互相之间的区别，除结合原理外，主要就是检测对应的荧光通道不一致，各位老师们可以根据自己仪器的实际情况，选择不冲突的荧光，进行多色搭配即可。

5. Fixable Viability Dye流式染色结果如何解读？

相对于未染色的细胞，Fixable Viability Dye染色的细胞整体都会检测到荧光信号，但是可以通过信号的强弱来区分活细胞和死细胞。其中活细胞的细胞膜完整，仅细胞表面蛋白胺基结合了染料，呈现较弱的荧光信号；而死细胞的细胞膜通透性改变，染料能够进入死细胞，与细胞内和细胞表面蛋白上的胺基结合，因此死细胞呈现更强的荧光信号。

Fixable Viability Dye流式染色结果解读。将未染色细胞和Fixable Viability Dye染色细胞流式分析结果合并分析。相对于未染色的细胞，Fixable Viability Dye染色的细胞整体都会检测到荧光信号，其中死细胞呈现比较强的荧光信号，而活细胞呈现的信号较弱。

其它常见问题

1. 可以将流式Fixable Viability Dye染色的细胞通过荧光显微镜观察细胞死活吗？

• 不建议，该染料对基于成像的实验效果不好，由于所有细胞都被染色，很难通过显微镜从暗淡的活细胞中分辨出明亮的死细胞。

2. DAPI到底能否做死活染料？

• 虽然Dapi有一定的膜穿透能力，但是是可以用于做死活染料的，有很多文献有相关结果可以证明，只是活细胞也会像FVS染料一样有部分着色，呈弱阳性信号。因此针对不同的细胞类型和细胞数量，可以适当进行DAPI染料的染色浓度摸索，以达到更好的分群效果。

3. 使用Fixable viability dye时，染色液有什么要求？

• 当使用可固定的细胞活性染料时，Tris缓冲液和含有叠氮化钠或外来蛋白质的溶液不能作为细胞染色缓冲液，因为溶液中含有这些物质可能导致死细胞群染色强度的显著降低和/或活细胞群背景染色的增加。一般冰冷PBS 1:1000染色，含有FBS的PBS终止。

4. 利用LIVE/DEAD Fixable dead cell stain或者是Fixable Viability Dye 胺基反应染料鉴定死活细胞，需如何制备补偿单染管？

• 补偿样本中需要同时检测到阳性信号和阴性信号，我们提供两种方案：
• 准备活细胞与死细胞的混合样本：将一份活细胞样本平均分成两份，一份不做处理，一份制备成死细胞，制备完成后将两份样本重新混合，再进行染色。制备死细胞的方法请参考如下描述：可以通过60°C放置20分钟热灭活细胞。或将细胞放入70%乙醇固定，乙醇固定的细胞可以保存在-20°C，使用前再取出。
• 利用ArC™ 胺反应补偿珠试剂盒（货号A10346），该产品可与具有胺反应性的LIVE/DEAD Fixable dead cell stain或者是Fixable Viability Dye可固定死细胞染料结合，以用于流式补偿调节，而无需自己制备补偿样本。