活体颅骨光透明技术在光学成像中的应用

活体颅骨光透明技术在光学成像中的应用

活体脑成像对于研究大脑生理病理活动有着至关重要的意义。现代光学成像技术侵入性低、分辨率高，因而能够用于活体观测生物结构和功能，在脑科学领域发挥着重要作用。但是，在活体状态下，大脑有颅骨覆盖，而颅骨对光的强散射和像差严重限制了光的穿透深度，进而影响了皮层成像的分辨率和深度。为了克服颅骨的散射，以往的研究往往需要在成像前建立各类手术颅窗，主要包括开颅玻璃窗、磨薄颅骨窗以及它们的变体。

磨薄颅骨窗的建立通过将部分颅骨磨薄至约 25 μm左右，从而实现对皮层的活体高分辨观测。但磨薄颅骨窗不适用于大视场观测皮层，因为将大面积的颅骨均匀地磨薄至25 μm的难度非常大。另外，颅骨被磨薄后会重新生长，并且新生的颅骨易碎，难以实现多次的重复打磨。所以，磨薄颅骨窗不适用于长期跟踪观测。开颅手术容易导致炎症反应及氧化应激反应，进而开颅后3天逐渐形成白色絮状物影响后续成像效果，且往往会持续约 2周，因此并不适合急性模型（3天以内）的观测及长期（2周以上）活体成像监测。

近些年兴起的组织光透明技术可以降低生物组织的散射，增强光在组织中的穿透能力，已被广泛应用于离体大组织甚至全器官三维高分辨成像。不仅如此，组织光透明技术在活体水平也得到了很好的应用。研究人员发展的活体颅骨光透明技术，以及基于此建立的光透明颅窗，可以在不进行开颅手术的情况下，结合多种现代光学成像手段，实现大脑皮层的神经血管结构和功能的无创成像观测。针对不同的应用场景，开发了不同的光透明颅窗，可以分别满足高分辨、大视场、长时程观测等要求。相比于开颅玻璃窗，光透明颅窗可以避免手术带来的炎症反应等副作用，从而适用于急性观测；而相比于磨薄颅骨窗，光透明颅窗可以通过反复操作而观测数月，从而实现长期跟踪监测。

目前的活体颅骨光透明方法包括以下几种：（1）SOCS:实现活体颅骨光透明[1]；（2）SOCW:实现穿颅神经树突棘成像[2] ；（3）USOCA:可开合的大视场颅窗[3]；（4）VNSOCA:可见-近红外兼容的光透明颅窗[4]；（5）用于长期观测的光透明颅骨窗（TIS）[5]。本文主要介绍活体颅骨光透明技术在光学成像中的应用。

激光散斑衬比/高光谱成像

激光散斑血流成像系统采用激光散斑技术，可以对组织血流进行连续监测，具有非接触、无创伤、快速成像等优点，可用于记录由于皮肤营养和体温调节等因素引起的毛细血管、微静脉和微动脉中的血流变化；高光谱成像技术是一种非标记的血氧分布成像技术。颅骨光透明技术的出现使其得以在完整颅骨下获取皮层血流及血氧信息。

图1. 重复光透明成像用于皮层血流和血氧监测[3]。（a）颅骨短期重复透明成像；（b）颅骨长期重复透明成像。

利用颅骨光透明技术，可以持续一周地每天对小鼠进行颅骨透明化操作并获取血流血氧信息（图1. a）。不仅如此，研究人员对 2 月龄的小鼠进行了每月一次、为期 5个月的持续成像，并成功观察到皮层血管网的动态变化，即部分血管的消失和新生（图1. b）。除了对单侧颅骨进行透明外，研究人员还对小鼠双侧颅骨进行光透明处理，用于监测大脑中动脉阻塞（MCAO）后双侧皮层血流及血氧变化（图2）。

图2. 光透明颅窗用于监测MCAO引起的皮层血流动力学变化[3]。（a）MCAO前后双侧皮层血流及血氧变化；（b-c）皮层血流及血氧变化柱状图。

光声成像

光声成像技术是近年来兴起的一种新型无损医学成像方法，兼具光学的高对比度和超声的高穿透性。

光声成像原理

当一束光照射到生物组织上，生物组织吸收光能量而产生热膨胀，伴随着热膨胀会产生超声波，吸收光能量的多少决定了产生的超声波的强度。不同的组织会产生不同强度的超声波，可以用来区分正常组织和病变组织。

光声成像技术特点

光声成像技术检测的是超声信号（该技术克服了光学成像技术在成像深度与分辨率上不可兼得的不足），反映的是光能量吸收的差异（补充超声成像技术在对比度和功能性方面的缺陷），结合光学和超声这两种成像技术各自的优点，能实现对组织体较大深度的高分辨率、高对比度的功能成像。

研究人员将活体皮肤光透明试剂注射到小鼠皮下后，对皮下血管进行光声成像。结果表明：在所有检测频率下，光声信号都显著升高，极大地改善了小血管和大血管的可视化，定量分析结果显示皮下血管造影深度增加了34倍（图3a）。此外，研究人员还将活体皮肤光透明试剂与超声凝胶混合后涂抹在小鼠皮肤表面，作为耦合剂使用。结果发现在试剂作用后，皮肤略微透明，大、小血管的可视化都得到了改善，并且光声成像深度显著增加，血管造影深度提高1.52倍（图3b）。

图3. 活体皮肤光透明用于光声成像获取小鼠皮下血管结构[4]。（a）小鼠皮下注射活体皮肤光透明试剂后，血管光声成像改善效果。（b）小鼠皮肤涂抹活体皮肤光透明试剂后，血管光声成像改善效果。

受激拉曼成像

受激拉曼散射成像是一种无需荧光标记的新型生物化学成像技术。依据物质中分子化学键振动频率的特异性，可以检测生物样本中的多类物质。展现出了无标记、快速、高灵敏度、高特异性等优势。研究人员通过受激拉曼成像分析了颅骨光透明过程中颅骨的主要成分---胶原蛋白和羟基磷灰石（钙质）的变化，对颅骨光透明技术的作用机制进行了分析。研究发现活体颅骨光透明的基本原理是（部分）去除颅骨中的钙质、脂质和蛋白质，并使用折射率匹配试剂进一步提高透明效果（图3）。该研究为未来活体光透明方法的发展提供了理论依据，可以用于筛选更高效的活体颅骨及其他组织光透明方法。

图3. 受激拉曼成像揭示颅骨光透明技术的机制[7]。（a-c）幼年小鼠顶骨中胶原纤维和羟基磷灰石显微结构图像。颅骨未处理（a），10 %胶原酶处理（b），10 % EDTA处理（c）。（d-f）成年小鼠顶骨中胶原纤维和羟基磷灰石的微观结构变化。颅骨未处理（d）， USOCA处理（e），10 % EDTA处理（f）。

双光子/三光子成像

与其它光学活体成像相比，双光子/三光子成像具有较高的空间分辨率，可实现细胞与亚细胞分辨水平的结构成像研究，以其大穿深、低光毒性、低光漂白等优点而被广泛应用于活体和活细胞/组织的成像观察。一般来说，双光子/三光子应用于神经科学研究时需要配合开颅玻璃窗或者磨薄颅骨窗，而活体颅骨光透明技术的发展为其应用提供了一种新型的非侵入式的观测思路。

如图4所示，活体皮肤光透明技术能够显著提升皮下免疫细胞双光子成像的效果。一方面，双光子成像获取的图像信号强度和信噪比都显著提高；另一方面，活体双光子成像的深度也得到极大提升（2~3倍）。

图4. 活体皮肤光透明用于双光子成像观测小鼠足部免疫细胞[1]

借助活体皮肤光透明技术，研究人员还研究了糖尿病对小鼠皮肤免疫功能的影响。在糖尿病小鼠足垫诱发延迟型超敏反应（DTH）后，通过双光子成像观察单核/巨噬细胞在不同时间点的响应。结果发现糖尿病小鼠DTH后单核/巨噬细胞的浸润和募集增加，但其运动能力明显减弱，说明单核/巨噬细胞免疫功能异常，并且其功能异常随着糖尿病的进展而进一步增强（图5）。通过体内皮肤光透明提高光学成像深度，可以比较炎症部位周围不同深度的单核/巨噬细胞的运动行为。对于正常小鼠来说，在DTH早期（DTH-4 h）皮肤深层单核/巨噬细胞的迁移距离明显大于浅层，而在DTH晚期（DTH-72 h）则相反，说明不同深度的皮肤免疫反应存在差异。

图5. 活体皮肤光透明用于双光子成像获取糖尿病小鼠不同阶段（T1D-1 w、T1D-2 w、T1D-4 w）在DTH后不同时间点（DTH-4 h、DTH-24 h、DTH-48 h、DTH-72 h足部单核/巨噬细胞募集情况[6]

与双光子成像技术相比，三光子成像技术拥有更高的空间分辨率。此外，由于三光子荧光与三次谐波发光所用的激发波长相较于双光子更长，因此具有更大的成像深度。这些特征使三光子成像在深层组织和高分辨生物成像领域具有重要的应用前景。而活体颅骨光透明技术同样可以用于三光子成像。经过颅骨光透明作用后，三光子成像获取的皮层血管三次谐波信号得到显著增加，而且皮层神经元成像的深度和对比度都得到显著提升（图6），这为脑皮层深层信号的获取提供了有力的手段。

图6. 光透明颅窗用于三光子成像[4, 5]。（a-c）颅骨光透明作用前后皮层血管白光图（a）、三次谐波信号（b）、神经元信号三维重构（c）。

光操控

现代光学技术不仅可以获得高分辨率的神经血管图像，而且可以对大脑皮层进行操控或建立特定的模型。基于颅骨光透明技术的窗口，也可替代开颅窗和磨薄窗，用于皮层光操控。比如，结合光透明颅窗和光动力效应，既可以打开血脑屏障，也可以建立靶向缺血性脑卒中模型；此外，透过光透明颅窗，将飞秒激光聚焦在血管上，可以实现对单根血管的烧蚀，从而建立局部靶向的出血性脑卒中模型。

研究人员利用光透明颅窗，在不开颅的情况下实现了光动力效应打开血脑屏障，并可以在活体水平跟踪荧光染料的渗漏过程（图7. a），随后进一步研究了光动力效对于不同年龄小鼠血脑屏障功能影响的差异性。这些研究为脑药物递送和脑疾病的治疗提供了一种新的手段。此外，研究人员还将活体颅骨光透明技术与光栓技术相结合，在非开颅的情况下，实现了对大脑皮层血管的靶向栓塞。通过改变激光照射位置和照射剂量，可以对栓塞程度和栓塞区域进行调节（图7. b），该模型可以用于评估溶栓药物对不同尺寸血管的溶栓治疗效果。

图7. 颅骨光透明技术用于皮层光操控[8, 9]。（a）光透明颅窗结合光动力效应打开血脑屏障；（b）光透明颅窗结合光动力效应实现光栓模型建立。

展望

活体颅骨光透明技术已经应用于多个领域，如神经血管成像、皮层光操控、建立特定的疾病模型等，为活体皮层观测提供了一个无需开颅的光学窗口。不同的脑科学研究对颅窗提出了不同的要求。比如，神经突触成像需要高分辨观测，许多疾病的研究需要长时程跟踪，急性病理模型需要建窗口立即观测，神经功能成像需要在清醒动物上开展，跨脑区研究需要较大的观测视场。而光透明颅窗发展至今，已同时具备了高分辨、大视场、长时程、适用于急性观测的优势，因而有望在某些传统颅窗无法胜任的场合（比如急性创伤性脑损伤的跨脑区观测）提供重要的技术支撑，从而在未来的脑科学研究中大放异彩。但是，仍旧要意识到目前颅骨光透明技术依然有所限制。比如，目前尚未有适用于更大动物（比如大鼠、猕猴等）的活体颅骨光透明方法，这需要研究人员继续探索更高效的颅骨光透明方法。未来更好的颅骨光透明的出现，结合更多的成像方法，会为脑科学的发展提供更有力的技术保障。

参考文献：

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[11]李东宇,俞婷婷,朱京谭,朱?.活体颅骨光透明方法及应用（特邀）[J].光子学报,2022,51(08):252-268.

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