生物界的"小透明"，到底有哪些魔法？
生物界的"小透明"，到底有哪些魔法？
人类非常善于学习，总能从大自然中得到启发，并将其应用在现实生活中。比如，生物体的"小透明"们，就让科学家们脑洞大开。
先进的组织透明化方法为来自单个器官、甚至一些哺乳动物的完整组织提供了亚细胞水平的光学检查。当与光片显微镜和自动化图像分析方法相结合时，现有的组织透明化方法可以加快科学研究速度，并可能将传统组织学的成本降低几个数量级。
——《自然综述：神经科学》
海洋中有这样一类生物，它们通体透明，比如玻璃章鱼、栉水母。凭借肉眼，如果不仔细看，很难发现它们。这种身体透明的"伪装"特性，可以帮助他们降低被捕食者发现的风险。
深海双生片足类囊虫。 图片来源： [1]
玻璃章鱼。图片 来源：[2]
透明海参。 图片来源： [2]
栉水母。 图片来源： [3]
它们是如何拥有透明的身体的呢？人类有没有可能改造细胞甚至生物，让它们变得透明？科学家们也非常好奇，并在过去一个多世纪为此做了大量研究。
为什么一些生物体是透明的？
科学家们透明化细胞的尝试起源于百年前，遗传理论和显微学不断发展的背景下，对微观世界的深入探寻。1906年，动物学家和细胞学家Michael Frederic Guyer提出，为了观察动物身体的细微结构，必须要使光穿过这些组织。但大部分组织极其不透明，无法对其中的结构进行彻底的检查。为此，Guyer提出 "透明化"（clearing）这一概念，并将其定义为"（使用化学试剂）将生物组织成分变透明"。
基于Guyer的理念，德国莱比锡大学的解剖学家Werner Spalteholz在1911年首次使用化学试剂对人和动物的组织（如心脏、肌肉、皮肤）进行透明化处理。根据Spalteholz文章中的描述，对心脏进行透明化处理后，"前房壁变得如此透明，以至于可以完全看透，心包脂肪变得像玻璃一样，右心室壁变得如此透明，以至于在适当的照明下可以追踪整个厚度的血管；左心室壁和隔膜的较厚壁用这种方法当然没有完全变得透明，但仍然可以深入几毫米进行观察。"这个方法在帮助人们了解器官中血管分布规律上起到了关键作用。
提到开发组织透明化方法的初心时，Spalteholz说，"通过（把完整组织）切成薄片，许多结构被破坏，每一部分之间的连接被打破。切成薄片有利于对细节的识别，但阻碍了对整体结构的识别。" 虽然Spalteholz把组织变透明了，但是由于缺乏对组织不透明现象的深刻理解，也对这些组织结构的完整性造成了破坏。
后来，科学家们发现了组织不透明的真正原因。原来，不透明的生物体要么吸收了照射在身体上的光，要么把光以散射的方式排出身体。如果生物体本身既不吸收光，也不散射光，那么它会变得透明。除了一部分色素外，细胞中大部分有机分子不会吸收可见光。因此，组织的不透明主要是由光的散射造成的。散射指的是光线通过不均匀介质时偏离原来的传播方向的现象，是由介质的折射率不匹配造成的。
与空气和玻璃这类简单均匀介质相比，生物组织的折射率要复杂得多。不但细胞内的细胞器（如线粒体，高尔基体，内质网）和细胞质的折射率不同，而且细胞和细胞间的溶液的折射率也有差异。除此之外，生物组织表面（如皮肤）和外部介质（如空气）的折射率也不一样。光线在穿过两种折射率不同的介质表面（如，细胞质-细胞器-细胞质，或细胞质-蛋白质-细胞质）时，其传播路线会发生改变。在如此复杂的组织内部多次改变传播方向后，绝大部分光线无法到达我们的眼睛。这也解释了为什么这些组织看起来是不透明的。
人们非常善于学习，总能从大自然中得到启发，并将其应用在现实生活中。科学家们基于Spalteholz的透明化方法，使用不同种类的化学试剂，在尽量保证不破坏组织内部原有结构的情况下，陆续开发了多种组织透明化的方法，将死去的、不透明的动物身体或者器官组织变得透明。例如，德国慕尼黑大学Ali Ertürk教授科研团队2019年开发的vDISCO方法，可以将完整的小鼠变得非常透明，而且对全身血管、免疫细胞、神经连接等结构进行荧光染色。
Ali Ertürk团队使用vDISCO透明化方法，将完整的小鼠进行透明化前后变化（a图： 透明化前； b图： 透明化后）。 图片来源： [4]
小鼠大脑组织透明化前后变化。 图片来源： [5]
上面提到的组织透明化方法，用的是死去的生物组织。那么有没有可能让活着的不透明的生物变透明呢？
目前，研究人员们可以通过操纵基因的方法去除活体生物组织中的色素，或者降低组织中分子对光的散射能力，以达到透明的目的。
例如，通过突变斑马鱼的mitfa基因，可以完全清除黑色的黑色素细胞。Roy orbison (roy) 斑马鱼是一种皮肤透明的突变体，黑色素细胞很少，而且完全没有具有光反射作用的虹彩细胞。这是因为像mitfa这样的突变色素基因负责生产生物体内的色素，改变这类基因就可以阻止色素的产生。
此外，理论上通过编辑与光学性质相关分子的基因，使它们的折射率和细胞质的折射率一致，降低光的散射程度，是可以实现透明化的。糖胺聚糖和鱼类中的防冻蛋白是已经被确认具有该种性质的分子。然而在基因操纵方面，该领域还没有明显进展。
组织变透明......然后呢？
把生物变透明不仅是为了满足了人们的好奇，致力于开发组织透明化方法的科学家们更希望，这种技术可以帮助我们在细胞或者分子水平上进一步理解生物体内部是如何精细运作的，以及理解疾病背后的复杂机制，从而更有针对性地开发相应的治疗药物，让人们的生活变得更美好。
生物组织变透明后一个最大的优势是，人们可以清楚地看到组织内部的3D结构。柳宗元在《小石潭记》中对潭水有这样一段描述："伐竹取道，下见小潭，水尤清冽……潭中鱼可百许头，皆若空游无所依。"潭水非常"透明"，可以清楚地看到水中游弋的鱼儿。透明的生物组织就像这清澈的潭水，可以看到组织内部很多精细的结构，包括健康组织的正常结构和组织生病后的异常结构。
那用什么去看这些结构呢？用我们的眼睛吗？
我们的眼睛虽然非常敏锐，但通常只能看到体积较大（大于0.1毫米）的东西，对于更小的东西就无能为力了。这时候我们需要使用光学显微镜来帮助我们观察微米级的生物结构。
生物组织的结构极其致密和复杂，即使有了光学显微镜帮助我们观察，我们也不能眉毛胡子一把抓，而是选择性地观察那些重要的、或者感兴趣的结构。
这时候我们就需要"教会"显微镜如何区分感兴趣的和不感兴趣的结构。现在最流行的一种方法是给那些感兴趣的结构打上"高亮标记"，也就是使用能够发出荧光的荧光蛋白。在特定的激光照射下，这类蛋白质分子能发出非常亮的各种颜色的荧光，比如红色、绿色、蓝色等，而正常生物组织很难发出这样的荧光（除了一些亮度比较弱的自发荧光）。这样的荧光蛋白有两个来源：一是对生物进行基因改造，使其表达特定的荧光蛋白；另一种是使用带有荧光标记的抗体对生物组织进行染色，这些抗体可以特异性地吸附在某种组织结构上。这些荧光被显微镜"捕捉"后，我们可以清晰地看到那些感兴趣的结构。
2.5个月大的Thy1- GFPM转基因小鼠大脑和脊髓，这种小鼠大脑中的神经元以及小脑中的苔状纤维可以特异性地表达发出绿色荧光的蛋白质。 使用vDISCO方法进行组织透明化。 图片来源： [6]
孵化后第9天的鸡胚胎。使用BABB方法进行组织透明化，然后使用荧光抗体对神经丝进行特异性染色。图片来源：[6]
组织透明化技术在肿瘤医学中发挥着重要作用。对经过透明化的组织进行成像是一件非常耗时的任务，通常至少需要持续几个小时，加上后期处理这些成像数据，至少需要十几个小时。医生为了快速对肿瘤患者的病理组织进行鉴定分析，通常使用只有十几~几十微米厚的病理切片。这种方法固然耗时短，但病理切片包含的肿瘤信息非常有限，容易发生鉴定错误。因此，对肿瘤组织进行三维观察，可以大大降低肿瘤组织鉴定的失误率。而且对肿瘤组织中的特定分子进行三维成像也可能为寻找治疗肿瘤的分子靶点提供新的见解。
人三阴性乳腺 癌样品。经过透明化后，对PROM1 mRNA（红色）和组蛋白（绿色）染色，然后使用光学显微镜进行三维成像。图片来源：[7]
后记
组织透明化技术最早于1911年问世，经过一个多世纪的发展，如今已经像魔术一样神奇。现在，我们有多种方法来透明化各种生物组织。想象一下，这就像给生物组织戴上了"隐形眼镜"，使得它们在显微镜下展现出完整的三维结构。随着显微镜技术的进步，我们能更加清晰地看到生物的内部世界。研究结构和功能之间的关系，需要在三维空间中进行探究，因此组织透明化技术在生物科学中扮演着关键角色。它不仅让科学家们的研究如虎添翼，还带来了一场视觉盛宴！
参考文献：
1.Cronin TW. Camouflage: Being Invisible in the Open Ocean. Curr Biol. 2016;26(22):R1179-r81.
2.Inyushin M, Meshalkina D, Zueva L, Zayas-Santiago A. Tissue Transparency In Vivo. Molecules. 2019;24(13).
3.Johnsen S. Hidden in plain sight: the ecology and physiology of organismal transparency. Biol Bull. 2001;201(3):301-18.
4.Richardson DS, Guan W, Matsumoto K, Pan C, Chung K, Ertürk A, et al. TISSUE CLEARING. Nat Rev Methods Primers. 2021;1(1).
5.White RM, Sessa A, Burke C, Bowman T, LeBlanc J, Ceol C, et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2008;2(2):183-9.
6. https://www.nature.com/articles/s41467-024-46770-2#Sec37
7. Tanaka N, Kanatani S, Kaczynska D, Fukumoto K, Louhivuori L, Mizutani T, Kopper O, Kronqvist P, Robertson S, Lindh C, Kis L, Pronk R, Niwa N, Matsumoto K, Oya M, Miyakawa A, Falk A, Hartman J, Sahlgren C, Clevers H, Uhlén P. Three-dimensional single-cell imaging for the analysis of RNA and protein expression in intact tumour biopsies. Nat Biomed Eng. 2020 Sep;4(9):875-888. doi: 10.1038/s41551-020-0576-z. Epub 2020 Jun 29. PMID: 32601394.
8. https://asset-downloads.zeiss.com/catalogs/download/mic/43f925be-5c7b-430d-a12a-e341c6a0c8d3/EN_wp_The-Art-of-Tissue-Clearing.pdf
9. https://www.nature.com/articles/s41583-019-0250-1
图片来源：
- https://www.cell.com/current-biology/fulltext/S0960-9822(16)31141-1?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS0960982216311411%3Fshowall%3Dtrue
- https://www.americanoceans.org/facts/clear-sea-creatures/
- https://diveadvisor.com/marine-animals/sea-walnut
- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6494982/pdf/nihms-1514194.pdf
- https://lifecanvastech.com/beginners-guide-to-tissue-clearing-with-lifecanvas-products/
- https://www.nature.com/articles/s41467-024-46770-2#Sec37
- https://www.nature.com/articles/s41551-020-0576-z