噬菌体疗法治疗严重细菌感染

噬菌体疗法治疗严重细菌感染

噬菌体疗法作为一种治疗细菌感染的替代方案，近年来在全球范围内引起了广泛关注。这种利用病毒来对抗细菌的治疗方法，不仅在临床上取得了显著成效，还在农业、畜牧业等多个领域展现出巨大潜力。本文将为您详细介绍噬菌体疗法的基本原理、发展历程及其在不同领域的应用前景。

噬菌体的基本特性与分类

噬菌体是病毒，具有所有共同的病毒特性：它们不在宿主体外复制，它们具有相对较小的基因组，它们广泛利用宿主机械进行复制，并且它们表现出紧密的宿主细胞特异性。有多种不同类型的病毒粒子形态，但最常见的是双链DNA ( ds DNA )尾噬菌体，其中DNA被包裹在附着在尾部的衣壳(头部)中(图1 )。感染是由尾尖附着在细菌细胞壁和从衣壳中注射基因组，穿过细胞膜，并进入细胞质启动的。蛋白质的衣壳和尾巴留在细胞外。

图1 治疗性有用噬菌体的例子

大多数噬菌体可以被分类为裂解性噬菌体或温和性噬菌体。在感染后，裂解性噬菌体追求单一的发育程序，包括早期噬菌体基因表达，基因组复制，晚期裂解性表达病毒粒子结构和组装基因，组装完全包装的颗粒，最后细菌裂解。温带噬菌体也可以遵循这种裂解性生长的模式，但在感染早期就对是否进行裂解性生长或建立溶原做出了"决定"；根据噬菌体、宿主和条件的不同，溶原性频率从百分之几到大多数感染都有很大的变化。20，21在溶原性中，裂解生长所需的基因被关闭，噬菌体基因组被建立为前噬菌体，通常通过整合到宿主染色体上。裂解性噬菌体对其感染的细菌细胞具有很高的杀灭比例，因此适合用于治疗。相比之下，温和性噬菌体感染后仍有很高比例的细胞存活(作为溶原)，因此温和性噬菌体是治疗的糟糕选择。然而，这些可以被设计成强制性的裂解，将它们转化为治疗候选物。

噬菌体的发现与筛选

天然存在的或“环境”中噬菌体几乎可以在地球上发现细菌的任何一个生态位中找到，包括海洋、湖泊、土壤、植物和动物。噬菌体通常在其细菌宿主也存在的环境中大量存在，因此，可以在发现有大量感兴趣物种的细菌的地方，如污水处理厂和动物或人类社区下游的废物中寻找环境噬菌体。通常，来自感兴趣地点的水或土壤样品通过0.22微米的过滤器，以去除细菌、真菌和其他大于病毒的实体。将滤液分层到接种有细菌草坪的平板上，以寻找裂解性噬菌体，或将细菌与宿主一起孵育以进行培养。然后观察平板在琼脂中出现的斑块(净空区)，表明该位置的细菌已经裂解。噬菌体可以在支持其生长的细菌上连续传代并扩增为空斑纯化；这种搜寻可以在相对较低的成本下进行，几乎没有复杂的设备。尽管在地理和噬菌体基因型之间似乎没有很强的相关性，但需要进一步的研究，这可能有助于噬菌体发现至少一些病原体。

噬菌体库的建立与应用

特征明确的噬菌体库可以作为文库，从中可以获取治疗性噬菌体用于临床，作为转基因噬菌体的起始材料或作为构建全合成噬菌体的智力框架。尽管合理的配方总是需要特征明确的噬菌体集合，但越来越多的细菌特异性噬菌体库已经被充分表征，可以进行高度集中的噬菌体搜索，用于个体患者或临床试验。覆盖来自给定细菌菌株的大多数临床分离株所需的噬菌体库大小在很大程度上取决于噬菌体生物学和靶病原体遗传学和相互作用决定因素。在金黄色葡萄球菌的情况下，可以鉴定出宿主范围相对广泛的噬菌体，合适的噬菌体文库可能仅由20或30个噬菌体组成。噬菌体宿主范围较窄的细菌种类（如鲍曼不动杆菌）可能需要超过300个噬菌体的噬菌体文库才能提供类似的覆盖。细菌物种内的噬菌体宿主范围是开发一种或多种针对细菌物种的噬菌体的“固定混合物”是否可行的关键决定因素。这种混合物已被提议用于治疗具有更广泛宿主范围噬菌体的细菌物种（例如，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌）。然而，这种混合物目前不适用于治疗主要具有窄范围噬菌体的细菌物种，例如鲍曼不动杆菌或脓肿分枝杆菌。这些生物体将需要定制的噬菌体混合物或专注于开发更广泛宿主噬菌体的噬菌体工程。固定噬菌体混合物具有生产和部署更简单的优势，但可能缺乏多价性，而定制混合物通常提供多价性，但对临床开发和临床使用都提出了更复杂的挑战。

噬菌体疗法的临床应用现状

如上所述，许多备受瞩目且描述良好的临床病例报告，加上更广泛可用的噬菌体鉴定和生产技术，导致噬菌体在过去几年中在临床医学中的更广泛使用。在美国，美国食品药品监督管理局 （FDA） 的紧急研究新药流程提供了监管框架，大多数这些经验都是在这种框架下进行的。

在过去的 10-15 年中，出现了越来越多的更详细的病例报告（图2A），这从关于 PubMed.gov 的文献数量中可以看出。考虑到与病例报告相关的选择偏倚，肺部感染以及植入血管和骨科装置的感染占所描述病例的一半以上。大多数更现代的经验都报道了在优化的背景抗生素治疗中加入噬菌体。随着能够制备近 GCP 级治疗性噬菌体的技术的发展，噬菌体疗法越来越多地通过静脉内给药。最近一项关于噬菌体施用对人类和动物的安全性的全面审查得出结论，无论途径如何，噬菌体施用通常都具有良好的耐受性.60 非肠外递送途径允许使用制备不太严格的噬菌体，但它们向感染部位的有效递送可能会受到许多因素的影响。例如，肠道感染的噬菌体治疗需要确保噬菌体通过胃的配方，胃酸可能会破坏胃的活力。

图2 按年份列出的噬菌体治疗报告和噬菌体研究

噬菌体的基因组工程

噬菌体基因组工程涉及两个主要步骤：“构建”和“选择或恢复”（图 3）。多年来，已经开发了许多方法来构建工程噬菌体并从亲本菌株库中恢复所需的后代。构建组分通常由宿主或噬菌体衍生的重组系统介导，噬菌体编码的重组酶可以在“重组”菌株中赋予高水平的同源重组。这些很容易用于许多基于噬菌体lambda Red系统的革兰氏阴性细菌，但可以通过利用这些宿主噬菌体的重组系统来开发宿主特异性系统。这种方法是电穿孔 DNA 噬菌体重组（BRED） 的基础，该重组是为分枝杆菌的工程噬菌体而开发的，但已适用于其他细菌宿主。由于重组过程是有效的，因此可以通过对几个噬菌斑进行简单的 PCR 分析来识别所需的后代。然而，不同类型的突变的恢复效率不同；例如，简单缺失的恢复频率高于基因插入或替换。BRED 用于通过精确删除噬菌体阻遏物来构建温带分枝杆菌噬菌体的强制性裂解变体，这些变体用于治疗。这些方法可以应用于其他遗传易处理的细菌，但它们对研究不足的病原体不太有用。

图3 噬菌体工程中使用的方法

CRISPR-Cas系统允许对不同噬菌体进行无标记工程改造，但受到细菌宿主的限制，这些宿主具有可用于表达 CRISPR-Cas 系统和维护编辑模板的遗传工具箱。此外，需要围绕基因组进行多次修饰的复杂遗传性状的工程改造需要顺序克隆和逆选，这使其成为一项耗时的工作。尽管噬菌体编辑和工程项目比几年前容易得多，但研究人员仍然需要更快、更广泛适用的技术，这些技术不受遗传工具箱和病原体细菌的限制，用于制造大量噬菌体。合成基因组构建为通过设计构建基因组提供了强大的新策略（图 4）。现在有方法可用于合成噬菌体大小的基因组（50 kbp），这些基因组可以通过在允许的细菌宿主中重新启动或通过无细胞转录翻译 （TXTL） 系统进行繁殖，当天然噬菌体不可用或明确需要专门设计的遗传添加时，这种方法特别适用。合成策略要么使用合成寡核苷酸来组装整个噬菌体基因组，要么通过用修饰/合成的基因组支架部分替换可用基因组支架的一部分来产生嵌合噬菌体。体外组装的噬菌体基因组要么直接电穿孔到细菌细胞中，要么在酿酒酵母中的酿酒酵母-细菌穿梭载体中亚克隆，然后将构建体移动到细菌细胞中以诱导噬菌体产生（用于“启动”）噬菌体。

图4 构建合成噬菌体基因组

噬菌体疗法的未来展望

为了应对 AMR 的全球威胁，WHO 和联合国机构间工作组批准了一种基于“同一个健康”概念的多管齐下的方法：人类、动物和环境之间的相互作用。虽然该框架传统上应用于抗生素管理，但最近在噬菌体疗法的背景下对其进行了评估，并且可以应用于我们下面讨论的其他噬菌体应用（图 5）。

图5 从 One Health 的角度来看潜在的噬菌体治疗应用

除了使用噬菌体治疗细菌感染外，噬菌体疗法还可能用于治疗细菌导致发病机制的慢性疾病。例如，微生物组肠-肝轴与酒精性和非酒精性脂肪性肝病 （NAFLD） 和非酒精性脂肪性肝炎 （NASH）以及肠易激综合征 （IBS） 相关的炎症反应有关。尽管确切的因果途径尚未阐明，但临床前研究很有希望，并计划进行临床试验，以确定噬菌体疗法是否可用于选择性靶向肠道微生物组中的粪肠球菌和肺炎克雷伯菌，以减少进展为肝病和与克罗恩病相关的侵袭性大肠杆菌。

早在 1926 年，噬菌体对肠道沙门氏菌（血清型支链）的裂解活性就在体外得到证实。然而，当相同的噬菌体口服给鸡治疗沙门氏菌病时，它没有成功，可能是因为它被胃酶或酸破坏了。直到 1980 年代，噬菌体疗法在兽医学和畜牧业中的应用在很大程度上被忽视了，它已成为几篇评论的主题，涵盖了其用于治疗或预防家禽和家畜中的沙门氏菌、大肠杆菌和弯曲杆菌的用途。

对农业中抗生素使用的监管限制越来越多，这激发了人们对使用噬菌体来减少食物链中 AMR 的更大兴趣，这一直是其他评论的主题。首次记录使用噬菌体治疗植物中的细菌病原体发生在1924 年，当时它被用来防止卷心菜腐烂。随后， 噬菌体已被评估为防止马铃薯、玉米枯萎病和柑橘溃疡病的一种方法。几种噬菌体产品已经商业化并获得美国环境保护署的批准，包括一种噬菌体混合物，用于预防葡萄藤中由叶缘焦枯病菌亚种引起的皮尔斯病。

噬菌体疗法已成为前苏联部分地区的标准护理，已有80多年的历史。在几十年来基本上被西方抛弃之后，它在过去7年中经历了强劲的复兴，尤其是在医学方面。欧洲、英国和澳大利亚正在进行越来越多的临床试验，以评估各种噬菌体制剂在治疗不同患者群体的多重耐药细菌感染中的作用。转基因和合成噬菌体的临床试验现已开始，但在安全性方面面临更严格的审查。即使没有临床试验的疗效数据，越来越多的国家（例如，美国、比利时、法国、瑞典、澳大利亚，以及最近的英国）已经建立了一个“平行轨道”，当抗生素选择失败时，噬菌体疗法可以根据具体情况批准用于同情使用。扩大噬菌体疗法的障碍包括后勤和监管挑战，但显然是可以克服的。

噬菌体制剂在农业、水产养殖、畜牧业和兽医学中也有很大的潜力来显著减少抗生素的使用，但需要额外的实证数据来标准化方法、措施和结果。 鉴于全球 AMR 的负担越来越重，在 COVID-19 大流行期间恶化，迫切需要全球协调的方法来标准化指南和方案。以及开发共享资源，如噬菌体库和 GMP 设施，以优化临床级噬菌体的生产，并将这些资源扩展到中低收入国家。尽管噬菌体不太可能完全取代抗生素，但鉴于大多数抗生素用于农业和畜牧业，从“同一个健康”的角度来看，基于噬菌体的方法可以显着改善抗生素管理。

参考文献
Strathdee, S. A., Hatfull, G. F., Mutalik, V. K., & Schooley, R. T. (2023). Phage therapy: From biological mechanisms to future directions. Cell, 186(1), 17–31. https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.11.017