细胞培养操作说明书

细胞培养操作说明书

细胞培养是生物医学研究中的基础实验技术，广泛应用于细胞生物学、分子生物学、药理学等多个领域。掌握正确的细胞培养操作方法对于确保实验结果的准确性和可靠性至关重要。本文将详细介绍细胞换液、传代、冻存和复苏等基础实验操作的详细步骤，帮助研究人员更好地开展相关实验工作。

细胞换液

所需试剂：细胞完全培养基（推荐使用海星生物细胞配套专用培养基）

1. 细胞处理后的第二天，在显微镜下观察细胞状态，如死细胞较多且细胞密度较低，需要进行换液操作。

• 悬浮细胞请在高倍镜下观察，一般而言，活细胞轮廓圆润、界限清晰、透明度大、折光性强。如细胞活率较高，则继续正常培养。
• 贴壁细胞如观察到较多细胞漂浮，请在高倍镜下观察，判断漂浮着的细胞是死细胞还是暂未贴壁的活细胞。如细胞活率较高，则继续正常培养。
• 半贴壁细胞正常培养会有部分细胞漂浮，属正常现象。请在高倍镜下观察，判断漂浮着的细胞是否是死细胞。如细胞活率较高，则继续正常培养。

2. 如需换液，参考以下步骤：

• 悬浮细胞：收集培养容器中的所有细胞悬液。250 g离心4 min后弃去上清。使用预热的完全培养基重悬，将细胞悬液接种到合适的培养容器中。
• 贴壁细胞：直接弃去培养容器中的上清，添加预热的完全培养基至原培养容器中。
• 半贴壁细胞：收集培养容器上清中的所有细胞，250 g离心4 min后弃去上清。使用预热的完全培养基重悬，接种至原培养容器中。

3. 之后，每2~3天更换一次完全培养基，后续根据细胞生长密度和状态传代或冻存。

注意：若发现异常情况，应及时排查原因，并与我们联系。

细胞传代

所需试剂：细胞完全培养基，贴壁和半贴壁细胞需要同时准备以下试剂：0.25% Trypsin-0.04% EDTA（货号: GUTP-R001，以下简称胰酶）1×PBS（货号: GUPB-R001，以下简称PBS）

1. 预热完全培养基（贴壁和半贴壁细胞还需要预热胰酶和PBS）。

2. 细胞收集。

• 悬浮细胞直接收集培养容器中的所有细胞悬液至离心管中。
• 贴壁/半贴壁细胞需要对细胞进行消化处理，步骤如下：
  1. 用PBS洗涤细胞2次。洗涤过程中注意动作轻柔，清洗全面。
• 贴壁细胞直接弃去培养容器中的培养上清。用PBS洗涤细胞2次，洗涤后的PBS直接弃去，无需保留。
• 半贴壁细胞需收集培养容器中的培养上清至离心管中。用PBS洗涤细胞2次，洗涤后的PBS需收集至离心管中。
  2. 加入胰酶，迅速铺匀，确保其充分接触细胞表面。
  3. 显微镜下观察消化情况，约70%~80%细胞收缩变圆后，轻拍培养容器外壁，使细胞脱离培养容器底面。立即加入胰酶双倍体积的完全培养基，轻摇培养容器，使培养基和胰酶迅速混匀，终止消化。
  4. 吸取细胞悬液，吹打培养容器底面数次，尽可能将细胞都吹打下来。将细胞悬液转移至离心管中。

3. PBS洗涤培养容器1~2次，收集所有细胞悬液至离心管中。

4. 收集的所有细胞悬液250 g离心4 min。

5. 离心后去除上清。加入2 mL预热的完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀。

6. 将细胞接种至适宜的培养容器内。

注意：如未计数，也可按照适宜比例进行传代，但请根据细胞实际生长情况灵活调整传代比例。

7. 摇匀细胞，将培养容器放入细胞培养箱中。

8. 后续根据细胞生长密度和状态进行补液（悬浮细胞）/换液（贴壁/半贴壁细胞）、传代或冻存等操作。

细胞冻存

所需试剂：冻存液（推荐使用海星HyCyteTM一步冻存液，即用型、无血清、无需程序降温，货号：GUCP-R201）

1. 待细胞生长至可传代的密度，即可准备冻存。

2. 消化细胞，取少量细胞悬液计数。细胞悬液经250 g离心4 min。

3. 离心后去除上清，用适量4℃预冷的冻存液重悬细胞。将细胞按比例或数量分装至冻存管中。一般冻存密度为(1.0~2.0)×106个/mL。

注意：细胞长时间在非培养条件下放置会严重影响细胞的状态。如离心后用冻存液重悬计数，请将细胞放置于4℃冰箱内，以减弱细胞代谢，较好的保持细胞状态。

4. 如使用海星一步冻存液，冻存管直接竖直放入-80℃冰箱即可完成“一步”冻存。如使用程序冻存液，需将冻存管放入提前预冷的程序降温盒后放入-80℃冰箱。

5. 24小时后可将冻存管转移到液氮进行长期保存。

注意：细胞不可长期保存在-80℃冰箱中。建议24 h后尽快转移至液氮中。

细胞复苏

所需试剂：细胞完全培养基（推荐使用海星生物细胞配套专用培养基）

1. 开启37℃水浴锅。预热完全培养基，提前将细胞从液氮中取出，放于-80℃冰箱，让冻存管中液氮挥发。

2. 洁净工作台内准备15 mL离心管，加入5 mL预热的完全培养基。

3. 从-80℃冰箱中取出细胞。快速将冻存管置于37℃水浴锅内，快速晃动，使冻存液迅速融化。

注意：

• ① 融化过程必须晃动冻存管，保证冻存液融化均匀。晃动时应避免水没过管盖增加污染风险。
• ② 管内冻存液融化至只剩一个约2mm直径的冰晶时，可停止水浴。继续晃动冻存管至冰晶融化。

4. 用75%酒精消毒冻存管表面。在洁净工作台内小心开盖，尽量避免气泡溢出，轻柔吹打数次，转移至预先准备的离心管内。用少量完全培养基洗涤冻存管1~2次，一并收集至离心管内。

5. 250 g离心4 min。离心后去除上清。加入2 mL完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀。（如有台盼蓝可取少量细胞悬液进行染色计数）

6. 将细胞平均接种到1个T25培养瓶或底面积相当的培养容器中，加入足量完全培养基，摇匀细胞，将培养容器放入培养箱中培养。

7. 复苏次日，观察细胞状态并换液，具体操作见”细胞换液”。

注意：贴壁/半贴壁细胞接种24 h内不应扰动。部分细胞贴壁较慢，复苏后48 h不应扰动，具体注意事项见相应细胞说明书。

细胞处理原则

• 严格的无菌环境。务必保证实验室、超净台/生物安全柜和培养箱的清洁。
• 规范的操作方式。请按照操作说明描述的方式操作，注意操作细节。
• 需要合适的、质量可靠的实验耗材和试剂。使用的试剂必须经验证可靠，适宜细胞生长且批间差异小。