qPCR金标准MIQE指南之实验重复性及异常案例分析
qPCR金标准MIQE指南之实验重复性及异常案例分析
荧光定量PCR（qPCR）技术在分子生物学研究和临床检测中扮演着重要角色。为了确保实验结果的可靠性和重复性，2009年发布的MIQE指南为qPCR实验提供了全面的最低信息要求。本文将重点介绍实验重复性的概念，并分析导致复孔间重复性不佳的常见原因，帮助科研人员获得更高质量的实验结果。
1996年，世界上第一台商用实时荧光定量PCR仪器在Applied Biosystems诞生，在过去近三十年时间里，荧光定量PCR仪已成为分子生物学研究的常规设备。从科学研究到临床检测，从早期的“非洲猪瘟”检测到近期的“新冠病毒”检测， 荧光定量PCR仪已成为不可或缺的设备。在科学研究过程中开展qPCR实验，会涉及到实验设计、样品准备、实验方法、数据分析等多个步骤，整个过程也会出现许多的不确定度因素，一些重要的实验细节没有足够被重视的话，也会影响结果的可靠性和重复性。
为了提高qPCR相关研究的有效性和质量，实现实验较好的可靠性和重复性，制定一套qPCR标准非常有必要。因此，在2009年，由多名科学家联合制定的“The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments（评估实时荧光定量PCR实验所需最低信息量）” 以期刊的形式发表于《Clinical Chemistry》，MIQE指南为qPCR实验提供了一套全面的最低信息要求，并为审稿人和期刊编辑提供了一个公认的标准，用于评估待发表文章的质量。因此，参照MIQE指南将最终产生更一致、更有可比性和更可靠的数据，促进实验室之间的结果比较和交流，推动qPCR技术的广泛应用和发展。目前MIQE 指南已成为最佳 qPCR 检测设计和透明报告实验结果的公认标准。
MIQE指南描述了评估qPCR 实验所需的基本信息，为qPCR文章发表作者提供了一套qPCR实验流程的“检查清单（checklist）”，包括9大类（实验设计、样本、核酸提取、逆转录反应、目的基因信息、引物信息、 qPCR实验方法、 qPCR结果确认、数据分析），共计85个参数。这些检查项分为E级（必须提供）和D级（最好提供）两种，通过记录和提供所有qPCR相关的实验条件和结果，从而确保高质量、可重复的的qPCR数据。
图一：MIQE checklist
从最初的实验设计，到最终的数据分析，MIQE指南对每一个过程都进行了详细的要求。比如实验设计中定义了实验组和对照组、每个组的数量等，比如对样本的描述、样本处理量、处理程序等等，这里不再赘述，感兴趣的老师可以参考MIQE原文。本文主要介绍一下实验重复性概念及分析复孔间重复性不好的一些案例，帮助大家能够得到更好的实验结果。
什么是实验重复性？
在qPCR实验中，实验重复性主要包括两个概念：生物学重复（Biological Replicates）和技术性重复（Technical Replicates）。
生物学重复（Biological Replicates）是指不同生物学个体或样本接受相同处理或条件进行的重复实验，qPCR实验之所以要设置生物学重复，是由于不同生物个体，组织或培养样品间基因表达水平的内在差异会导致生物学差异，为减少生物学差异的影响，qPCR实验会设置生物学重复，以此来评估实验结果在不同个体间的可重复性和生物学变异性。
技术性重复（Technical Replicates）是指使用同一份生物样本的核酸进行的多次独立实验操作，也就是大家常说的复孔。qPCR实验之所以要设置技术性重复，是因为在qPCR实验操作过程中会有随机误差，比如由移液操作或移液器本身等原因导致的随机差异，所以qPCR实验会设置技术性重复，即从同一个生物个体或同一份样品中提取的RNA或DNA，在完全相同的实验条件下进行多次qPCR实验，以验证实验结果的准确性，提高结果的可信度。所以qPCR实验中应该联合设置有生物学重复和技术重复样品（图二）。
图二：生物学重复及技术性重复示例
在平时做荧光定量PCR实验的时候，经常会遇到实验重复性（即生物学重复和技术重复）比较差的情况，我们可以通过梳理实验流程的方法去找到不理想的原因，并尝试将问题解决。
首先来看下影响生物学重复的因素，主要包括：
检测样本的处理与取材应保持一致。基因表达往往是有时空特异性的，同一处理下不同的样本取材部位或取材时间不一致，会导致检测结果差异放大，因此同一实验设计的所有样本需取材部位及时间应保持一致；另外应选取大小均一，生长条件和遗传背景一致的实验材料，严格按照实验设计进行相同的处理。
提取的RNA质量会影响对应的实验结果。如果提取的RNA出现不同程度的降解，就会导致重复性差，因此应该把控RNA提取的整个流程，选取对应不同样本类型的、合适的RNA提取试剂盒，最大程度去除抑制剂残留，防止RNA降解，最终得到高质量的RNA。此外，不能忽略残留基因组对实验的影响，应该选用具有去除基因组功能的RNA提取试剂盒或者选用具有去除基因组功能的反转录试剂，消除基因组的影响。如果能够跨外显子设计定量引物，使基因组序列不被扩增，也是消除基因组的影响一种方法。得到RNA后，在反转录时要参考对应的反转录试剂盒，不要超过反转录试剂盒推荐的上限，不同样本的RNA上样量也尽量保持一致。
样本个体本身的差异所带来的的影响，不同的生物个体之间受环境遗传等因素影响会有不同程度的系统误差，对于差异大的个体生物学重复性也会较差，所以应尽量选取遗传背景一致的供试实验材料，增加生物学重复数量，得到更接近真实值的统计结果。
接下来再看一下技术重复比较差的情况，这也是平时qPCR实验中常常遇到的，本文列举几个常见的重复性差的案例供大家参考。
- 由于软件设置原因导致复孔重复性比较差
在qPCR实验中当遇到扩增不理想数据时，首先应该先看下软件设置是否正确，可以对照试剂盒说明书，检查时间、温度、循环数、荧光采集等是否设置正确。当遇到复孔重复性差的现象时，这时候应该检查对应反应孔基线、阈值线设置是否异常。实验中选用的耗材、试剂或者操作的原因会导致背景荧光信号有所波动，从而造成反应孔的自动基线扣除错误，常见的有基线的范围设置太短或者太宽。比如图三这个案例，在检查基线自动设置时，发现一个反应孔的基线自动设置不正确（基线设置的比较短），最终导致复孔重复性差，遇到这种情况可以参考之前文章“一分钟解决问题之基线阈值线调整”采取手动调整基线的方法，重新定义基线即可正常，即将基线起点改为荧光信号稳定的循环数（一般是3），基线终点要改成扩增曲线起峰的前一个循环数（比如该案例起峰是在第19个循环，那基线的终点就是18）。
图三：基线自动设置太短，导致复孔重复性差结果图及更改后结果图
基线自动扣除错误另一个常见现象是基线设置太宽，这种现象一般在模板量比较大，也就是Ct比较小的时候容易出现，例如图四所示案例，由于一个反应孔的基线自动设置比较宽，最终导致复孔重复性差，同样，按照基线手动调整规则，更改正确基线后，重新分析最后得到重复性比较好的结果。
图四：基线自动设置太宽，导致复孔重复性差结果图及更改后结果图
- 试剂耗材问题导致复孔重复性比较差
在qPCR实验中试剂耗材的正确选用非常关键。首先应该确保所选用耗材规格跟仪器加热模块规格一致，否则容易出现复孔重复性比较差的现象，比如 0.2ml加热模块用成0.1ml耗材，则会造成反应管的外壁和荧光定量PCR仪器的温控模块没有充分接触，从而出现热传导不充分，进而影响酶的活性，会引起重复性不好（图五）。
图五：耗材规格跟加热模块不匹配造成重复孔间差异
此外，在耗材选择上尽量选择质量、品牌好一点的，目前市面上荧光定量PCR耗材种类繁多，质量也是良莠不齐，切莫因为便宜选用质量很差或不符合要求的耗材，否则会引起一系列问题，引来实验的困扰，造成不必要的时间、精力、试剂和样本的浪费。例如质量比较差的耗材密封性可能不好，最终导致液体不同程度挥发，从而导致复孔间重复性不好（图六）。
图六：试剂蒸发造成重复孔间差异
- 实验操作问题导致复孔重复性比较差
实验操作是qPCR实验的基础，如果一些实验操作的细节没有注意到，也容易导致复孔重复性比较差。比如从冰箱冷冻中取出的试剂是否有混匀，如果试剂融化后没有混匀，这时候取出的试剂不是均一的。另外定量PCR预混液跟核酸模板加好后是否混匀，这些都会影响后面的扩增（图七）。
图七：试剂不均一造成重复孔间差异
另外在实验操作中容易忽略的是移液器的准确性，有些移液器长时间未校准，可能在加样时候造成误差，建议定期校准移液器（图八）。
图八：移液器加样误差造成重复孔间差异
- 参比荧光问题导致复孔重复性比较差
为了校正仪器系统以外的物理误差，比如加样的误差（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光性能）、仪器稳定性（如孔间、批间波动）等误差，监控反应体系 (是否存在样品的蒸发)，Applied Biosystems系列荧光定量PCR 仪器默认用ROX来作为参比荧光染料。ROX只是最常见的参比荧光染料，还有MUSTANG PURPLE等其他荧光染料可以作为参比荧光。比如市面上一款白血病融合基因PML-RARa检测试剂盒用的是TAMRA作为了参比荧光，如果没有仔细阅读说明书，错把ROX作为参比，这时候也容易得到重复性不好的结果，这时候只需将TAMRA荧光改为参比荧光，重新分析数据，结果重复性恢复正常（图九）。
图九：错把ROX作为参比荧光（左图）及TAMRA作为参比荧光(右图)
- 低拷贝样品导致复孔重复性比较差
最后一个比较常见的容易导致复孔重复性比较差的原因是样品本身拷贝数比较低。比如当模板浓度低或者基因表达丰度低的时候，Ct值往往大于30，复孔间Ct值差异比较大。这时候可以尝试提高模板浓度，或者选用灵敏度高的反转录和qPCR试剂，针对低丰度模板能够得到高效特异的扩增。
以上是我们常见的一些复孔间重复比较差的例子，希望能够帮助各位老师处理类似异常的问题。除了本文提到的几种情况之外，在平时实验过程中我们可能还会遇到其他的异常情况，有些我们需要具体问题具体分析，也欢迎大家跟赛默飞的技术支持团队进行沟通和交流。