鬼笔环肽-细胞骨架染色原理及实验操作流程

鬼笔环肽-细胞骨架染色原理及实验操作流程

鬼笔环肽是一种从鬼笔鹅膏中分离出来的双环七肽，能够特异性地与纤维状肌动蛋白（F-actin）结合，广泛应用于生物显微技术中。本文将详细介绍鬼笔环肽的结构、功能、实验操作流程以及注意事项，帮助研究人员更好地理解和应用这一重要工具。

细胞骨架是网状纤维结构，是高度动态的，不同时期有不同的形态。它主要是由微丝，微管和中间丝所组成的。微丝主要是肌动蛋白组成的，肌动蛋白分成肌动蛋白单体（G-actin）和纤维状蛋白单体（F-actin）。微丝的组装就是G-actin 变成F-actin的过程。

图1.细胞骨架结构（包含微丝，微管和中间丝）。图片来源：《医学细胞生物学：第七章 细胞骨架与细胞的运动》

鬼笔环肽是一种双环七肽，最早发现的环状肽之一，是从鬼笔鹅膏（Amanita phalloides）中分离出来的。通过结合和稳定纤维状肌动蛋白（F-actin）发挥功能，并有效防止肌动蛋白纤维解聚。由于其与F-肌动蛋白的紧密和选择性结合，从而显示微丝骨架在细胞中的分布，因此含鬼笔环肽的荧光标记已广泛用于生物显微技术中。

图2.鬼笔环肽Phalloidin 的结构

值得注意的是，未经修饰的鬼笔环肽无法穿越细胞膜，这使其难以直接应用于针对活细胞的实验。FITC和Rhodamin等荧光物质标记的鬼笔环肽可特异的与真核细胞的F-actin结合，从而显示微丝骨架在细胞中的分布。

实验流程

鬼笔环肽的配制

0.1mg鬼笔环肽溶于1ml无水甲醇（也可用DMSO或无水乙醇溶解）配成贮存液，可在-20度避光的条件下长期保存，工作液的浓度为5ug/ml，由贮存液加PBS稀释20倍即可。

染色程序

PBS清洗细胞2次，每次10分钟；3.7%-4%的甲醛或多聚甲醛固定20分钟，PBS清洗细胞2次；加入5ug/ml的FITC-鬼笔环肽室温染色30-60分钟，夏季时间可以短一些，PBS清洗细胞2次；DAPI或hoechst33258染细胞核10分钟，PBS清洗细胞2次；吸去多余水分，加荧光封片液（中性或偏碱性缓冲液加等量甘油），盖上盖玻片，荧光或共聚焦显微镜下观察。

客户实例

客户来源：四川大学口腔医院

细胞类型：骨髓间充质干细胞

标尺：100μm

引文出处：Zhu Z , Jiang S , Liu Y , et al. Micro or nano: Evaluation of biosafety and biopotency of magnesium metal organic framework-74 with different particle sizes[J]. Nano Research, 2020, 13(2):511-526.

产品介绍

染色使用的产品为FITC标记鬼笔环肽，染色为绿色荧光。图片为通过MTT法和FITC标记鬼笔环肽以及DAPI染色确定Mg-MOF74对BMSCs的安全剂量，确保后续实验在安全剂量的范围内进行。

细胞类型：骨髓间充质干细胞

标尺：50μm

引文出处：Fan Z, Xiao L, Lu G, Ding Z, Lu Q. Water-insoluble amorphous silk fibroin scaffolds from aqueous solutions. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2020;108(3):798-808. doi:10.1002/jbm.b.34434

产品介绍

染色使用的产品为罗丹明标记鬼笔环肽，染色为红色荧光。图片为罗丹明标记鬼笔环肽染色以及DAPI染核，在共聚焦显微镜下观察不同再生丝素蛋白支架上骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化的情况。

总结

荧光和生物素化的鬼笔环肽衍生物，与肌动蛋白抗体相比具有明显优势。鬼笔环肽偶联物的结合不会随物种（包括动植物）的肌动蛋白变化而发生明显改变。此外，他们的非特异性染色可忽略不计。因此染色区和未染色区之间的对比度很高。

注意事项

• 鬼笔环肽的分子量小，很容易通过细胞，不需要对细胞进行冷丙酮和TRITON X-100处理。
• 毒性较大，戴上手套操作。

产品特点

• 亲和力高：Kd= 20 nM；
• 特异性强：选择性结合于丝状肌动蛋白F-actin，而不会与单体肌动蛋白G-actin结合；
• 优于抗体染色：鬼笔环肽无物种限制，且几乎不存在非特异性染色，染色区和非染色区域对比性极其明显；
• 灵敏度高：纳摩尔浓度（nM）染色即可满足实验要求；
• 兼容性好，肌动蛋白活力不受影响：鬼笔环肽衍生物很小，直径约12-15Å，分子量＜2000 Da，标记后的肌动蛋白许多生理特性都得以维持；
• 适用范围广：无物种差异性；同样适用于甲醛固定和打孔处理后的组织样本。

FAQ

Q1：鬼笔环肽染色可以在活细胞中进行吗？
A：鬼笔环肽的染色需要对样品进行固定和透化，帮助鬼笔环肽和F-actin的结合，得到更好的染色效果。

Q2：我的细胞样品转染了带有GFP的质粒，我应该选择哪一款鬼笔环肽？
A：可以选择TRITC（橙色），iFluorTM 555（橘色）或是iFluorTM 647（远红）标记的鬼笔环肽。

Q3：染色贴壁细胞，每个样品大概需要多少工作液？
A：染色贴壁细胞只需要染色工作液能够完全覆盖细胞即可。

Q4：几种不同的鬼笔环肽的区别是什么，如何选择？
A：是荧光基团的不同，激发出的荧光颜色不同，用于区分共染时其他荧光染料的荧光颜色，对于选择需要机器满足激发和发射波长要求。

Q5：鬼笔环肽染色存在种属区分吗？
A：对于动物活细胞染色，不区分种属。