揭示转录因子位置依赖性：解密基因调控的空间密码
揭示转录因子位置依赖性：解密基因调控的空间密码
在基因组中，转录因子（TFs）通过结合特定的DNA序列来调控基因表达。然而，尽管许多调控元件包含相似的TF结合位点模式，但基因调控的结果却呈现出多样性。这引发了一个核心科学问题：相似的TF结合位点组合是如何编码并产生不同基因表达程序的？目前，科学界仍难以仅从DNA序列准确预测基因表达模式，对大多数人类基因的转录调控机制也尚不完全清楚。
先前的研究已经揭示，TF结合位点的间距、方向、拷贝数以及亲和力等因素均能对转录输出产生影响。然而，关于TF结合位点如何具体构建基因调控程序的普遍规律仍然缺乏，这限制了我们对基因组功能的深入理解和解释。
最近，一项发表在Nature杂志上的研究“Position-dependent function of human sequence-specific transcription factors”通过探究人类序列特异性转录因子在不同转录起始位点（TSSs）的功能，揭示了TFs对转录起始的影响是位置依赖的。研究通过分析TF结合位点相对于TSS的位置，发现了多个具有高度优选位置的序列模式。该研究利用自然遗传变异、内源性TF蛋白水平的扰动以及大规模并行分析自然和合成的调控元件的方法，展示了TFs结合对转录起始的位置依赖性影响。这些发现为理解相似的TF结合位点组合如何根据其空间配置产生不同的基因调控结果提供了新的视角，并揭示了DNA序列多态性可能导致转录变异和疾病的机制。
在基因组中，转录因子（Transcription Factors, TFs）通过与特定DNA序列的结合位点相互作用来调控基因的表达。然而，不同转录因子在基因启动子（Promoters）和增强子（Enhancers）中的结合位点往往呈现出相似的组合模式，这些组合模式如何编码并调控多种重叠的基因表达程序，仍是当前生物学研究的一个重要课题。为了深入探究转录因子结合对转录起始的位置依赖性影响，研究采用了自然遗传变异分析、内源性转录因子蛋白水平的扰动实验，以及大规模并行分析自然和合成调控元件的方法。
在研究设计中，构建了三种不同的DNA插入片段，用于进行TSS-MPRA（Massively Parallel Reporter Assay，大规模并行报告基因分析）。每种设计均包含400-500个长度为155 bp的DNA插入片段，并与4或5个独立的11 bp条形码进行耦合，以优化分子特性和增加多样性，从而每种设计最终生成了2000个DNA插入片段。
通过细致分析转录因子结合位点相对于转录起始位点（TSS）的位置，研究发现了多个具有高度优选位置的序列模式。例如，NRF1、NFY和Sp1等经典转录激活因子，在特定位置下既能激活也能抑制转录起始，其功能发挥取决于它们相对于TSS的精确位置。
在细胞实验方面，研究选用了U2OS、HepG2、HEK293T和Vero E6细胞进行培养，培养条件为37°C和5% CO2，培养基为含10% FBS的DMEM。实验中使用了siRNA和mRNA进行转染，并在24小时后收集RNA样本进行后续分析。此外，还进行了csRNA-seq（small capped RNAs, ~20–60 nucleotides）分析。csRNA-seq和总小RNA-seq的输入测序读数使用HOMER工具进行修剪，并与相应的基因组（GRCh38/hg38, GRCm38/mm10）进行比对。仅考虑唯一比对的读数（MAPQ≥10），并丢弃剪切或软剪切的比对读数，以确保准确的TSS位置。
最后，研究还进行了突变分析，通过TSS-MPRA评估转录因子结合位点突变对转录起始的影响。选择了133个人类启动子和增强子进行突变，并发现突变后的转录因子结合位点在其自然富集的位置上与转录抑制相关，而在其他位置上的突变则与转录起始增加相关。
转录因子功能的依赖位置效应研究
图a：核苷酸频率偏差分析
在人类U2OS细胞的转录起始位点（TSS）附近，我们观察到了核苷酸频率的显著偏差。这一数据揭示了TSS区域内核苷酸分布的非随机性，可能反映了特定序列模式对转录调控的重要性。
图b：TF结合位点的基因组范围富集
通过全基因组分析，我们发现多种转录因子（TF）的结合位点在活跃TSS的特定位置上显著富集。特别是NRF1、NFY和Sp1等TF，在TSS上游区域显示出明显的富集趋势，而在TSS下游则显著减少，这暗示了这些TF在转录调控中的位置依赖性功能。
图c：结合位点的富集或耗尽模式识别
利用HOMER2工具，我们识别了TF结合位点相对于TSS的位置分布模式。结果显示，如NRF1等TF的结合位点在TSS上游显著富集，进一步证实了TF结合位点的位置特异性。
图d：结合位点的功能分布总结
我们对463种已知人类TF的结合位点进行了全面分析，总结了它们在TSS相对位置上的富集或耗尽情况。这一分析揭示了不同TF结合位点在不同位置的分布规律，为理解TF在转录调控中的复杂作用提供了重要线索。
图e、f：结合位点位置与转录活性的关系探究
通过敲除NRF1实验，我们探究了其结合位点相对于TSS的位置对转录活性的影响。结果显示，当NRF1结合位点位于TSS上游时，TSS的转录活性降低；而当结合位点位于TSS下游时，转录活性则增加。这一发现揭示了NRF1结合位点位置对转录调控的精细调节作用。
图g：模型验证实验
为了进一步验证结合位点相对于TSS的位置对转录活性的影响，我们过表达了一个无转录活化域的NRF1突变体（dnNRF1）。结果显示，无论NRF1结合位点位于TSS上游还是下游，均会导致转录活性的降低。这一实验为NRF1的位置依赖性功能提供了有力证据。
图h：NRF1功能模型提出
基于以上分析，我们提出了NRF1结合位点位置对TSS去抑制的模型。我们认为，NRF1在TSS上游的结合位点可能通过空间阻碍机制抑制下游TSS的转录起始。这一模型的提出为深入理解NRF1在转录调控中的作用机制提供了新的视角。
TF结合位点的定位偏好及其功能机制研究
研究发现，转录因子（TF）结合位点在转录起始点（TSS）周围的偏好位置，是这些因子在调控转录起始过程中功能特性的直接反映，揭示了它们在转录调控中发挥的多种机制作用。
具体而言，不同TF的结合位点展现出显著的定位偏好。例如，NRF1的结合位点更倾向于位于TSS的上游区域。这种上游偏好性可能意味着NRF1在转录起始前的调控阶段发挥着重要作用，如通过影响染色质结构或招募其他转录共调节因子来调控基因表达。相比之下，YY1的结合位点则偏好位于TSS的下游区域。这种下游定位可能暗示了YY1在转录延伸或转录后加工阶段的功能，或者它可能通过与转录机器的其他组件相互作用来影响转录过程的进行。
自然遗传变异揭示转录因子结合位点的位置依赖功能及类别
图a和b：遗传变异对基因调控的位置依赖性影响
研究通过基因组中的自然DNA多态性分析，揭示了遗传变异如何显著影响基因调控。以SPRET小鼠株系为例，图a和图b展示了NF-κB（p65）结合位点的遗传变异如何导致下游转录起始的减少（图a）或解除转录起始的抑制（图b）。这些结果明确表明，基因调控是位置依赖的，即突变的结合位点相对于转录起始位点（TSS）的位置决定了其对转录的影响。
图c：Sp1结合位点突变的位置依赖功能
图c展示了Sp1结合位点突变对转录起始的位置依赖性影响。研究发现，当Sp1结合位点因变异而削弱时，其在优选位置（上游TSS）显著与转录减少相关，而在下游TSS位置则显著与转录增加相关。这一结果进一步证实了TF结合位点的功能依赖于其相对于TSS的位置。
图d：信号依赖的TF功能位置依赖性
图d通过刺激NF-κB（p65）结合位点的突变实验，展示了这些结合位点的功能在受到KLA刺激后的显著改变。这一发现进一步证实了TF功能的位置信号依赖性，即TF结合位点的功能不仅受其相对于TSS的位置影响，还受到外部信号刺激的调控。
图e：TF类别的功能分类
图e总结了TF结合位点的功能类别，将其分为纯激活因子（如PU.1）、纯抑制因子（如ZEB2）和双功能因子（如Sp1）。这一分类揭示了TFs在调控转录起始中的功能依赖于其结合位点相对于TSS的位置，进一步强调了位置依赖性在TF功能中的重要性。
图f：全基因组范围内的TF结合位点突变影响
图f展示了全基因组范围内的TF结合位点突变对转录起始的影响。研究发现，在463种已知人类TF结合位点中，有300种以上的结合位点在至少一个位置上与转录起始变化显著相关。通过对这些TF结合位点的功能影响根据其相对于TSS的位置进行分类，研究进一步证实了TF在基因调控中的功能是高度位置依赖的。
为验证相关发现，本研究团队设计了一种长度为150 bp的合成DNA序列，并在该序列中以2 bp为间隔插入了NRF1、NFY、YY1或Sp1的结合位点。通过TSS-MPRA（转录起始位点大规模并行报告基因分析）技术捕捉到的结果显示，转录因子（TF）结合位点的插入往往诱导新的转录起始位点（TSSs）的出现，这一发现进一步佐证了TF结合位点对RNA聚合酶II招募及定位的强大影响力。
在自然增强子区域的验证研究中，我们对增强子区域内的NRF1结合位点进行了扫描分析。结果表明，NRF1结合位点的具体位置不仅决定了转录起始的位置和频率，而且其他TF结合位点的存在也会对NRF1的功能产生显著影响。
通过对疾病相关变异位点的分析，我们发现这些变异位点通常紧邻TF结合位点，且这些变异能够显著影响TSS的选择，进而改变基因表达水平和基因调控程序。例如，全基因组关联研究（GWAS）鉴定出的变异位点rs11122174位于一个NRF1结合位点内部，显示出与邻近TSS位置相关的位点依赖性变化模式。
在全基因组范围内，TF结合位点的定位与其功能之间存在显著的相关性。具体而言，活化因子如Sp1、NRF1和NFY在其结合位点位于TSS上游时促进转录起始，而当这些位点位于TSS下游时则抑制转录起始。
此外，我们还分析了多个TF结合位点的间距和相对位置，发现这些TF之间的协同作用能够显著影响转录起始的位置和频率。这一发现揭示了TF结合位点的空间配置在基因表达调控中的关键作用。
本研究揭示了TF结合位点的空间配置如何解码基因组中的调控信息，对于理解基因调控机制以及非编码DNA突变如何导致疾病具有重要意义。未来的研究可以通过进一步深入探索和实验验证，有望在精准医疗和基因治疗领域取得重要突破。例如，利用TF结合位点的定位偏好，可以设计出更为有效的基因调控工具，用于治疗因基因表达失调所引起的疾病。
综上所述，本研究通过系统的实验设计和数据分析，揭示了转录因子结合位点的空间配置在基因表达调控中的核心作用，为理解复杂的基因调控网络提供了新的视角。未来的研究可以进一步探索其他转录因子的定位偏好及其在不同生物学过程中的功能，从而推动基因组学和生物信息学领域的持续发展。