肌红蛋白异常升高之谜
肌红蛋白异常升高之谜
在医学检验领域，准确解读检测结果对于临床诊断至关重要。本文通过一个肌红蛋白异常升高的临床案例，深入探讨了检测结果异常背后可能的干扰因素，并详细介绍了嗜异性抗体对检测结果的影响及其应对方法。
众所周知，肌红蛋白（myoglobin，Mb）是心肌损伤的蛋白标志物。肌红蛋白分子量小，仅17.5kD，且位于细胞质内，故心肌损伤后出现较早，是AMI发生后出现最早的可检测的标志物之一，是一个具有153个氨基酸的多肽链和一个含铁血红素辅基组成的亚铁血红素蛋白，存在于骨骼肌和心肌等组织。由于骨骼肌和心肌组织中的Mb免疫学性质相同，因此用免疫学方法无法将其分辩开。
随着单克隆技术的发展，目前以酶免法，化学发光法，比浊法等方法测定Mb较多，本实验室2个检测系统（仪器不同，试剂厂家不同）均采用乳胶增强免疫比浊法的检测原理，且均采用生化分析仪两点法进行读吸光度数值来计算Mb的浓度。
患者男，朱某某，现病史：既往体健，2024年7月6日晚，因咽喉部阵发性针刺样疼痛伴左耳部疼痛，拟诊“咽喉部及左耳部带状疱疹病毒感染”入住耳鼻喉科进行住院治疗。
诊疗经过：立即进行了肝肾血脂血糖心肌酶，血常规，凝血常规，单纯疱疹病毒抗体检测等项目检查。其中总胆红素19.3umol/L,直接胆红素9.3umol/L，肌红蛋白>1199ng/mL，其余均无异常。
在审核报告时注意到了肌红蛋白大于1199的检测结果，本实验室肌红蛋白的参考区间是0—70ng/mL，于是立即点开肌红蛋白反应曲线，并无异常发现，可是心肌酶谱其他指标均正常。反应曲线如下图所示：
点开电子病历，患者并没有心肌或骨骼肌相关的疾病表现，难道是因为带状疱疹病毒感染导致感染部位肌肉组织损伤导致？首次病程记录如下图所示：
因仪器肌红蛋白设置有自动稀释模式，肌红蛋白大于1199ng/mL，若再次放入样本，仪器会自动将样本使用生理盐水试剂盒稀释10倍进行检测。于是带着质疑将样本再次放入仪器，点击开始进行检测，此时是仪器自动稀释的检测模式。过了一会，检测完成后结果为57ng/mL。如下图所示：
看到结果，有点惊讶，并且此时正是忙碌的夜班，一时感到不知所措，安静几分钟后分析结果，难道是第一次大于1199的结果是偶然误差？于是再次将样本以原倍模式放入仪器进行检测，并同时取出肌红蛋白的质控品同时进行检测。
质控品的靶值是128ng/mL和329ng/mL，检测结果为130ng/mL和329ng/mL。质控结果与靶值几乎接近，说明肌红蛋白的检测没有问题，并且其他样本肌红蛋白并没有出现此情况。样本再次检测结果大于1186ng/mL，反应曲线也正常，说明并不是偶然误差造成的。质控靶值与结果如下图所示：
复查样本结果如下图所示：
那么究竟是什么原因呢？于是想到了自己手动稀释样本看看结果，于是将样本使用生理盐水手动稀释了2倍，4倍，10倍，在手动乘以稀释倍数前，结果分别是281ng/mL,9ng/mL,7ng/mL。如下图所示：
看到结果，计算手动稀释的结果并不成比例关系。恍然大悟，应该是样本中有某种物质冒充了肌红蛋白，与包被在乳胶颗粒的肌红蛋白抗体进行了非特异性的结合引起吸光度的变化导致的。因本实验室的另一台检测系统夜间是关闭状态，于是致电临床医生，说明了情况，并怀疑嗜异性抗体的干扰，若是此抗体，对患者本次的诊疗没有影响，只是有可能会干扰某一些检测项目的结果。
于是请临床医生询问病人，在日常生活与工作中，是否有动物接触使，过一会儿，得到的答案是患者工作环境旁边，有猫，狗等动物，患者长期在此环境中工作。为了后续验证具体的干扰物质是否是嗜异性抗体，于是将血清分装2支，一支用于第二天另一台检测系统肌红蛋白的测定与类风湿因子的测定，放置冷藏保存。另一支用于使用嗜异性抗体阻滞剂后，在相同检测系统再次行肌红蛋白测定，放置冷冻保存。
待第二天早上8点结束夜班工作后，此时另一台检测系统的质控已检测完成，并且肌红蛋白在控，将冷藏样本恢复室温后，放置仪器进行检测，结果为42.7ng/mL。如下图所示：
类风湿因子检测结果为<20IU/mL，结果阴性。因本实验室无嗜异性抗体阻滞剂，于是联系其他医院与第三方检验公司。但是两台不同的检测系统在未稀释的情况下，结果分别是>1199ng/mL和42.7ng/mL。这是为什么呢？
为了了解不同检测系统在未稀释模式下，检验结果差距如此之大的原因，查阅了两个不同肌红蛋白生产厂家的试剂说明书，大于1199ng/mL的肌红蛋白试剂R1为柠檬酸缓冲液，R2为胶乳溶液，如下图所示：
于是致电该厂家试剂研发部门询问肌红蛋白的抗体是如何获得的，回复是将人肌红蛋白作为抗原注射小鼠中，最终提取到的鼠抗人肌红蛋白抗体，包被在乳胶颗粒形成的。42.7ng/mL的肌红蛋白试剂R1为甘氨酸缓冲液，R2为包被有羊抗人肌红蛋白抗体的胶乳颗粒。如下图所示：
查阅检验相关书籍，制备的抗血清分为R型与H型，R型抗血清是用家兔及其他动物免疫产生的抗体，抗原抗体反应比例合适范围较宽，适于作诊断试剂；H型抗血清是用马等大动物免疫获得的抗体，抗原抗体比例合适范围较窄，一般用作免疫治疗。
由此可知，相同抗原经过免疫不同动物产生的抗体虽然都能特异性的与相应的抗原进行结合，但是由于免疫动物的种属差异，所得抗体的基本结构相似的情况下，重链与轻链的氨基酸组成可能存在较大的差异，特别是抗体的Fc段。若抗原结构越复杂，抗原决定簇越多，则免疫不同种属的动物所得抗体的差异可能越大，在结构、特异性和亲和力上可能均存在差异。
结合本案例中出现的现象，干扰物与鼠抗人肌红蛋白抗体有非特异性的结合，与羊抗人肌红蛋白抗体无结合，通过查阅文献得知，天然的嗜异性抗体分为两类：一类（85%的假阳性或假增高由其引起）可结合于山羊、小鼠、大鼠、马和牛IgG的Fab区域，但不与兔IgG的Fab区结合；另一类（15%的假阳性或假增高由其引起）可结合于小鼠、马、牛和兔IgG的FC区表位，但不与山羊和大鼠IgG的FC区表位结合[1]。
因后续联系其他医院与第三方检验公司未找到嗜异性抗体阻滞剂或阻滞试管，是本案例的遗憾之处，可能与嗜异性抗体阻滞剂价格昂贵，一般实验室未采购有关。
嗜异性抗体（HeterophileAntibody，HA）是由已知或未知抗原物质刺激人体免疫系统分泌的，能与动物免疫球蛋白非特异性结合的一种内源性自身抗体。尤其是曾密切接触动物、进食受污染的食品、接受来源于单克隆动物抗体制剂治疗等都可能成为HA产生的原因。
嗜异性抗体产生的干扰归根结底是非特异性的抗原抗体结合导致的误差，根据实际反应的基本方法不同，比如直接法，间接法、竞争法、双抗体夹心法等，可能引起实验结果的假性升高或降低。
本案例的直接法引起结果的假性升高。在日常工作中遇到嗜异性抗体干扰时，多使用另一台检测系统或者更换检测方法进行测定，连续倍比稀释检测后非线性下降或升高来进行判断并纠正，封闭法使用阻滞剂特异性的结合相应种属源的异嗜性抗体，或者是物理化学的方法如聚乙二醇沉淀法，超速离心法，凝胶过滤法等[2]。
最后因未找到阻滞剂，将冻存的样本复溶后恢复室温，经16000r/min进行高速离心，取上清液在相同检测系统上进行测定，结果无明显改善。说明前三种方法更适用于临床。嗜异性抗体不仅干扰肌红蛋白的检测，很多基于抗原抗体反应原理的检测方法均有可能受其干扰[3]，所以识别干扰是我们检验人需要做的，才能更好的服务于患者。
在实际工作中，遇到干扰的情况不少。常见的干扰有溶血（体内溶血与体外溶血），样本脂浊、黄疸，抗凝剂污染，输液同侧抽血，样本中维生素C等药物，巨酶，类风湿因子，嗜异性抗体等的干扰。在工作中，当发现检验结果与临床表现不符，或者无法解释当前的结果时，应积极与临床沟通，回到检测实验本身去发现问题。切勿置之不理，不然极可能威胁患者的诊疗甚至生命。
参考文献
[1]裘宇容、李欣等嗜异性抗体对检验结果干扰的两例临床病例分析 [J]中华检验医学杂志2013年5月第36卷第5期
[2]黎锦、李一荣.内源性抗体对临床免疫检测的干扰及对策[J]中华检验医学杂志2016,39（11）:811-813
[3]李阳、莫合塔伯尔等嗜异性抗体所致化学发光法检测心肌肌钙蛋白I假阳性1例[J]中国介入心脏病学杂志2019年12月第27卷第12期