ELISA实验基础：新手也能轻松上手的专业指南

创作时间:

作者:

@小白创作中心

引用

来源

https://m.elabscience.cn/resource-elisa_research-detail-1960

ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种基于免疫反应的高灵敏度实验技术，自1971年被首创以来，已成为生物科学研究中不可或缺的重要工具。本文将为您详细介绍ELISA的基本原理、分类及其四种主要方法（直接法、间接法、夹心法和竞争法）的区别与优劣势，帮助您更好地理解和应用这一实验技术。

图1. ELISA基本原理（以双抗体夹心法为例）

ELISA是一种基于免疫反应的高灵敏度实验技术，其基本原理是：利用抗原抗体的特异性反应，结合酶对底物的高效催化作用，来检测靶蛋白的含量。

实验时，需要将抗原或捕获抗体包被于固相载体上，通过检测分子（酶或荧光基团），将化学信号转换为电信号，以OD值或发光值的结果，对靶蛋白进行定量分析。

ELISA可同时用于测定抗原和抗体。根据ELISA实验原理及操作的不同，可以将ELISA大致分为四类：直接法、间接法、夹心法和竞争法。

直接法将抗原或抗体固定到酶标板上，用带有酶标记的一级抗体或一级抗原，与之特异性结合，再利用酶催化底物显色，即可测定总靶标蛋白的含量。

间接法常用于检测抗体。将抗原固定到酶标板上，加入一抗，与抗原特异性结合，再加入带有酶标记的二抗，使二抗与一抗特异性结合，最后加入底物，使底物与酶反应显色，即可测定总靶标蛋白的含量。

夹心法分为双抗体夹心法和双抗原夹心法，适用于检测具有多个识别位点的大分子蛋白等。

双抗体夹心法ELISA：此方法常用于检测抗原。将抗体固定在固相载体上，加入待测抗原，与抗体特异性结合，再加入酶标抗体检测，并利用底物显色，即可测定总靶标蛋白的含量。
双抗原夹心法ELISA：反应模式与双抗体夹心法类似，用固相抗原和酶标特异性抗原，分别代替固相抗体和酶标特异性抗体，即可测定样品中的抗体。

夹心法ELISA的显色结果与待检抗原（或抗体）的量成正比。

竞争法适用于测定只有一个识别位点的小分子物质。其原理是：标本中的抗原及一定量的酶标抗原，竞争性地与固相抗体相结合。标本中的抗原含量越多，结合在固相上的酶标抗原就越少，最终显色也越浅。需要注意的是，显色结果与待检抗原（或抗体）的量成反比。

方法分类	间接法	直接法	夹心法	竞争法
适用性	在临床诊断中是检测标志性抗体的重要手段。	在实际中运用较少，只能测定酶标记的分子。	适用于检测具有多个识别位点的大分子蛋白等。	适用于小分子抗原，如激素和药物类的测定。
优势	① 不加酶标记的一级抗体能保留更多的免疫反应性，具有更高的灵敏度； ② 需要更少的标记抗体（二抗一般为多抗，可标记多个酶分子），更经济。	① 实验步骤少，检测速度快； ② 不需要用到二抗，避免了交叉反应，测定结果不容易出错。	高灵敏、高特异性，抗原无须事先纯化。	可适用于比较不纯的样本，数据再现性高。
劣势	① 发生交叉反应的机率较高（酶标二抗直接与抗原结合）； ② 实验中多了二抗孵育的步骤，实验周期延长。	① 由于抗原不是特异性固定，实验背景会比较高，灵敏度低； ② 检测对象有限，只能测定酶标记的分子。	① 抗原一定要拥有两个以上的抗体结合部位； ② 对配对抗体要求高，事先应优化降低捕获抗体与检测抗体之间的交叉反应性。	整体的敏感性和特异性都较差。