CHO细胞中乳酸代谢机理和调控策略

CHO细胞中乳酸代谢机理和调控策略

CHO细胞是生物技术中用于生产治疗性蛋白质（如抗体）的主要宿主细胞之一。乳酸的代谢和调控在CHO细胞培养中是提高产品产量和质量的关键。乳酸的积累不仅会影响细胞的增殖和产品的表达，还会导致细胞培养环境酸化，进而影响细胞的生长和代谢。因此，理解乳酸的代谢机制，并采取相应的调控策略是非常重要的。

乳酸的形成机制

大多数细胞依靠有氧糖酵解而不是线粒体氧化磷酸化产生细胞生物活动所需的能量，在细胞培养的指数生长阶段，约60%-80%的葡萄糖和16%-25%的谷氨酰胺转化为乳酸。随着细胞由快速生长期进入稳定期，乳酸由生成转变为消耗（图1）。

图1：细胞生长的不同时期乳酸的代谢路径

乳酸消耗途径涉及两种关键蛋白质：

• 单羧酸转运蛋白 (MCT)，乳酸和H+通过该蛋白共转运出入细胞；
• 乳酸脱氢酶 (LDH)，将乳酸转化为丙酮酸，使其进入三羧酸循环（图2）。

图2：乳酸的代谢示意图

生产中的乳酸代谢通常有三种类型，即乳酸消耗型、乳酸积累型和乳酸再生型（图3）。根据历史经验，乳酸浓度低于20 mM尚可接受，高于40 mM则会对细胞生长和产率造成不利影响。乳酸的累积不仅会抑制细胞生长，而且会导致pH下降，从而需添加碱液，进一步使渗透压升高，最终导致细胞培养环境恶化。因此，一般认为乳酸消耗型（乳酸代谢转换）是比较理想的代谢特征，即细胞可从乳酸生成途径转换至乳酸消耗途径。乳酸被及时消耗可以防止培养基酸化，使得pH更稳定。所以，碱液需求量减少，渗透压能维持在较低水平，从而可添加更多营养物以满足需求。乳酸是细胞代谢的特征产物，也是细胞营养物，检测细胞代谢是否异常，除了观察乳酸异常代谢外，还需要结合pH、渗透压、pCO2、糖消耗等其他生化指标及蛋白表达去综合判断。

图3：三种常见的Fed-Batch乳酸代谢趋势图

调控乳酸代谢的主要策略

乳酸代谢是一个复杂的过程，与细胞株、培养基、培养工艺和培养规模有直接关系，第二部分我们从培养基，培养环境，细胞株等方面来阐述在哺乳动物细胞生长过程中，减少乳酸生成的主要策略（图4）。

图4：减少哺乳动物细胞生物过程中乳酸产生的主要策略

通过优化培养基改善乳酸代谢

1. 采用代谢相对缓慢的碳源替代培养基中的葡萄糖和谷氨酰胺，比如利用果糖、麦芽糖和半乳糖替代葡萄糖，利用谷氨酸、丙酮酸、三羧酸循环中间体等替代谷氨酰胺来减缓乳酸的积累。有研究表明，用半乳糖替代葡萄糖，产生的乳酸显著减少，但降低了特定的细胞生长速率和峰值活细胞密度。为了提高细胞生物代谢，在补料分批培养的中，使用一种双相培养策略（交替葡萄糖和半乳糖消耗），乳酸积累显著减少，半乳糖化一定程度上改善。

2. 将葡萄糖维持在较低水平，从而降低糖酵解的通量和减少乳酸的生成，但同时需要考虑缺乏葡萄糖是否对糖基化修饰的影响。HyClone可提供无糖Cell Boost 7A作为补料，方便控制流加培养中葡萄糖的浓度。

3. Freund等报道了一种乳酸补充和适应 (LSA) 技术，该培养基和补料设计推动代谢平衡向乳酸消耗表型发展，在该技术中，CHO细胞适应了补充乳酸钠的培养基，既为细胞提供能量，同时控制培养物pH。该技术应用于Fed-Batch培养时，乳酸浓度下降8倍，活细胞浓度达到35M cells/ml。

4. 补充铜离子，在铜缺乏的体系补充，铜离子可有效改善乳酸异常积累，铜离子不宜过度添加，容易造成碱性异构体，Man5和聚体的增加。

5. 尝试不同配方的目录培养基，HyClone可提供原型培养基PSL A01、PSL A02改善乳酸积累并提高Titer（图5）。

图5：不同基础培养基中细胞乳酸代谢的对比

通过优化培养工艺改善乳酸代谢

1. 采用pH上限控糖法 (HIPDOG) 即基于pH变化调节葡萄糖流加量，当细胞培养中乳酸代谢由积累转变为消耗时，pH会上升，此时缓慢流加葡萄糖，使细胞产生少量乳酸，则pH会有所下降。之后，停止流加葡萄糖，使葡萄糖浓度下降，乳酸则会被消耗，进而使pH回升（如图6），采用HIPDOG的CHO流加培养工艺由于对乳酸的有效抑制，在产量和稳定性方面表现出了显著的提高。

图6：利用HIPDOG方法调整葡萄糖的流加策略

2. 降低培养温度和pH，在补料批培养中，观察到特定乳酸生产率与pH和温度的设定值之间存在线性相关性。有研究表明温度降低会减缓细胞代谢，葡萄糖和谷氨酰胺的消耗以及乳酸的产生都会减少。也有研究表明，pH设定值的降低，引起糖酵解酶活性和膜电位发生变化，从而导致葡萄糖消耗和乳酸产生减少。然而，由于这两种策略都会对细胞增殖、蛋白产量和糖基化产生不利影响，因此在PH和温度的双相培养调整中，乳酸代谢会根据具体情况进行优化，比如在不影响产品产量和质量的前提下，pH在小范围调整，温度在降温时间点和降温度数进行优化。

3. 改善传质，在大型生物反应器中也可能出现乳酸代谢不一致的情况时，可能是高pCO₂累积造成线粒体功能下降，从而阻止CHO细胞培养中从乳酸生产转变为乳酸消耗的正常转换。改善传质可以改善细胞代谢，减少二氧化碳的积累，促使乳酸从积累到消耗转变，另外改善传质时关注过高的搅拌速率和通气带来的剪切力。

更换细胞株或基因改造改变乳酸代谢通路

1. 更换细胞株，在单克隆筛选中需要考虑乳酸代谢的影响，以免在工艺放大中出现风险。

2. 降低葡萄糖消耗和乳酸生成速率，如下调乳酸脱氢酶LDH基因或上调抗凋亡基因BCL-2A的表达改善线粒体的活性。

3. 促进丙酮酸进入TCA循环，如上调丙酮酸羧化酶PYC和丙酮酸脱氢酶PDH的活性或抑制丙酮酸脱氢酶激酶PDK活性，上调苹果酸脱氢酶MDH等

4. 改善其他糖类代谢速率，可以选择提高果糖转运体GLU5以提高细胞消耗果糖的速率，并以果糖代替葡萄糖。

在优化培养基调控乳酸代谢的方案中，HyClone可提供改善乳酸代谢的原型培养基PSL A01和PSL A02，在维持低葡萄糖浓度的方案中，HyClone可提供无糖CellBoost 7A作为补料，方便调控葡萄糖的浓度。培养基货号如下表，如需更详细的产品资料或者Sample支持欢迎随时联系Cytiva HyClone相关同事。

参考文献

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