细胞免疫研究中的PBMC分离与保存标准化指南

细胞免疫研究中的PBMC分离与保存标准化指南

细胞免疫应答是机体维持稳态的重要组成部分。天然免疫选择性激活适应性免疫后，细胞免疫发挥杀伤清除功能。因此，对细胞免疫应答水平的评估在癌症诊断与治疗、传染性疾病诊断与预防以及疫苗免疫效果评价等方面意义重大。分析感染期间、给药后或疫苗接种后的细胞免疫反应是重要的生物样本分析检测指标。目前，对细胞免疫功能的检测主要以细胞表型、细胞增殖、细胞杀伤作用和细胞因子释放能力为主，分离后的外周血单个核细胞（PBMC）成了细胞免疫最常用的样本。

PBMC分离：关键步骤与注意事项

分离的PBMC样品主要用于免疫研究，在分离之前，血液运输和储存的时间和温度会显著影响检测结果。细胞活力的损失是PBMC样品质量随时间推移而下降的主要原因。由于粒细胞和红细胞的密度高于单核细胞，因此PBMC的分离是通过密度梯度介质来完成的。

常用的PBMC分离技术包括Ficoll密度离心法、CPT（BD）PBMC制备法和SepMate（StemCell）制备法。三种分离技术的细胞活力均可以达到100%，其中，CPT管因其操作简便、回收率高（比Ficoll高70%）且不受操作人员技术水平影响，成为广泛应用的选择。

分离注意事项：

• 无菌操作：全程在生物安全柜中进行，避免污染。
• 温度控制：离心及操作应在室温（18-25°C）进行，低温可能影响分离效率。
• 样本新鲜度：新鲜血液分离效果最佳，陈旧样本可能导致细胞活性下降。
• 离心技巧：关闭离心机制动，以维持分层清晰。

PBMC冻存与解冻的标准化流程

在免疫学测定中，使用新鲜细胞无疑是最佳选择，然而在实际操作中可行性不高，为了方便操作，多数采用冷冻的外周血单个核细胞（PBMC）。

冷冻与复苏过程会对细胞的活力和功能产生影响，这是无法回避的问题。所以，一旦使用冷冻细胞，就必须依据每项研究的具体条件，对细胞处理流程进行优化与标准化。只有制定出在不同采样和实验条件情况下均具备高重现性的方案，才能确保实验结果的可靠性和有效性，为后续研究奠定坚实基础。

这里列举了主要的冻存影响因素，包括冻存液、冻存条件和解冻过程。

冻存关键因素：

1. 冻存液选择：传统的DMSO+FBS冻存液存在异源物质风险，推荐使用无血清培养基。研究表明，无异种成分的冻存液对PBMC的活力和功能没有显著影响。
2. 冷冻速率：最佳冷冻速率为-1℃/min，可通过程序降温仪或Coolcell等无酒精降温盒实现。
3. 储存温度：液氮是PBMC的最佳储存环境，避免-80℃下液态水对细胞的损伤。

解冻技巧：

• 快速解冻：在37℃水浴中快速解冻，减少渗透压变化。
• 洗涤与离心：解冻后立即洗涤并离心，彻底去除冻存液成分。

Coolcell 细胞降温盒

冻存时间对PBMC功能的影响

尽管长时间冻存对PBMC细胞活力影响较小，但细胞功能可能随冻存时间延长而下降。也有最新研究表明，PBMC在冻存20年后仍能保持细胞功能稳定，这可能与冻存液配方等微小变量有关，进一步强调了标准化操作的重要性。

PBMC的分离与保存是细胞免疫研究中的关键步骤。通过优化分离技术、标准化冻存与解冻流程，您可以显著提升样本质量，确保实验结果的可靠性与重现性。无论是选择CPT管进行高效分离，还是使用无血清冻存液和液氮储存，每一步的精细操作都将为您的免疫研究保驾护航。

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