Nat Commun | 不同种植模式下植物和土壤微生物菌群间的“交流”

Nat Commun | 不同种植模式下植物和土壤微生物菌群间的“交流”

作物多样化种植模式如何影响植物与土壤微生物之间的相互作用？南京土壤研究所陈晏团队在Nature Communications上发表的研究为我们揭示了这一科学之谜。研究团队通过对比单一栽培、轮作和间作三种种植模式，发现作物多样化能够显著提高花生的产量和氮固定能力，并通过代谢组学和微生物组学技术，揭示了其中的分子机制。

植物和土壤微生物群之间的化学信号传导在微生物共生和根际微生物组装过程中起着关键作用。植物根系分泌物被认为可以吸引并过滤特定微生物类群。反过来，根际微生物释放的代谢物可触发植物响应，进一步调整微生物菌群的特异性和组成。2024年4月，南京土壤研究所陈晏团队在 Nature Communications 上发表了题为“Legume rhizodeposition promotes nitrogen fixation by soil microbiota under crop diversification”的研究论文，研究了不同的作物组合如何通过代谢物沉积以及自生固氮细菌的功能响应影响花生植物与其根际微生物群落之间的相互作用。

三种作物种植系统：PP，花生单一栽培；P-R，花生和油菜；PM-R，花生和玉米的间作，与油菜轮作，在花生开花期采集根际土壤和花生根系样本。

1.作物多样化提高花生的产量、根瘤形成和自生固氮

作物多样化对花生生产性能具有显著的积极影响。在作物多样性最高的系统中，即花生与玉米间作并与油菜轮作（PM-R），与花生单作（PP）和花生-油菜轮作（P-R）相比，花生的平均株高、生物量和果重分别增加了至少19%、66%和46%，最终导致作物混合系统PM-R中花生的氮吸收量比其他两种作物系统高51%。尽管轮作系统P-R中的花生生物量低于单作系统，但这并未影响果实产量。在根共生固氮方面，作者研究了根瘤的形成。不同处理之间差异显著：作物混合系统PM-R中花生的根瘤密度是单作花生的三倍，而根瘤与根质量比是单作花生的六倍。另外PM-R中花生根瘤密度比花生-油菜轮作P-R高出50%，根瘤与根质量比是花生-油菜轮作的两倍（图1a-b）。线性回归分析显示，花生植株生物量（图1d-e）与根瘤与根质量比显著正相关，而根际氨水平（图1g-h）与根瘤密度、根瘤与根质量比显著正相关。关于根际自生固氮，通过接种N同位素标记来测量微生物对N分子的固定。显然，培养7天后，作物混合系统PM-R中的土壤δN最高，比花生单作和花生-油菜轮作分别高出16%和4%（图1c）。花生根际的氨和硝态氮水平与土壤N固定呈正相关（图1f-i）。

与观察到PM-R处理对花生生长和固氮的影响一致，作物多样化也导致花生根际养分可用性的改善。特别是，作物混合系统PM-R中硝酸盐（NO-N）和铵（NH-N）的水平比分别比花生单作高出52%和125%，这种影响对总N的影响较小（只有9%），但仍然显著。在整体土壤中，不同种植系统的养分（包括总氮、NO-N、NH-N、总钾和有效钾）没有差异，但有机碳（SOC）、总磷和有效磷在PM-R或P-R中分别比花生单一栽培增加了至少6%、12%和115%。总体而言，除总钾外，整体土壤的养分水平平均比相应的根际值低17-59%。与根际土壤相比，整体土壤中持续较低的土壤养分可用性与其显著较低的pH值有关。

图1 作物多样性对花生根瘤和根际氮有效性的影响。

2.作物多样化改变了花生根际代谢物的组成

研究团队利用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC–MS/MS）技术，鉴定及注释到447个代谢物，包括苯环型化合物、碳氢化合物衍生物、脂质、核苷酸类、有机酸及其衍生物、有机氮化合物、有机氧化合物、有机卤素化合物、有机杂环化合物、苯丙烷类和聚酮类。主成分分析（PCA）显示，PC1和PC2分别解释了数据集的29.7%和13.5%（图2a）。代谢物的层级聚类热图显示出了与PCA类似的样本分离情况。在使用两倍变化阈值的情况下，研究团队发现了49种在PM-R与PP之间显著不同的代谢物，以及202种在PM-R与P-M之间显著不同的代谢物。有四种代谢物在PM-R与PP、P-M比较组中被显著富集（FC>2，p < 0.001）（图2b）。根据一级、二级质谱与标准品质谱的比较，这四种代谢物被初步鉴定为槲皮素、金丝桃苷、莨菪亭和丁香醛。因此，作物多样化使花生根际富含特定的黄酮。

图2 作物多样性对花生根际代谢产物的影响。

3.作物多样化增强了花生根系用于特定代谢物生物合成基因的表达

为了确定作物多样化下代谢物富集的来源，研究团队对花生根进行了转录组测序，比较了PP和PM-R系统中花生根部的基因表达。正如预期的那样，转录组数据PCA清楚地显示了PP 和PM-R两组样本间的分离（图2c）。与PP相比，PM-R中有2,911个差异表达基因（DEGs）（FC>2，q < 0.05），包括1322个下调基因和1,589个上调基因（图2d）。KEGG富集分析发现，DEGs主要富集于ABC转运蛋白、苯丙烷生物合成、细胞色素P450相关代谢以及其他有机物的降解或代谢等途径（图2e）。鉴于代谢组分析的结果，研究团队重点关注苯丙烷和黄酮生物合成途径，发现PM-R vs PP比较中分别有48个和8个DEGs在这两个途径中富集。GO功能富集显示，大多数DEGs特异性地富集到了过氧化物酶活性和黄酮生物合成过程。利用qPCR对15个具有代表性的基因进行检测，结果显示与花生根转录组数据一致，除了参与beta-葡萄糖苷酶生物合成的基因。总的来说，这些结果为作物混合系统中玉米和油菜的存在诱导了花生根中黄酮和苯丙烷生物合成途径提供了强有力的证据，导致这些代谢物在根际的积累。

4.作物多样化改变了花生根际细菌群落

鉴于作物多样化对花生根代谢生物合成和释放的影响（图2），研究团队接下来研究了这些根际化学变化是否会对根相关细菌群落产生连锁效应，共检测到4649个ASVs。分析发现增加作物种类似乎对细菌的α多样性产生了负面影响，只有Shannon指数显示出显著差异，而基于Chao1指数没有发现显著差异（图3a）。此外，作物多样化导致了更大的变异性，如PCoA的第一主成分所示（图3b）。相对于单一栽培，花生根际微生物组成异质性随着作物的多样化而降低，表明不同作物的共存诱导花生使根际相关微生物组成更加均匀。另外作物多样化增加了某些优势门的相对丰度，如Chloroflexi和Gammaproteobacteria，而Alphaproteobacteria则减少（图3c）。特别是，属于Gammaproteobacteria的几个ASVs在PM-R的花生根际中富集（图3d）。线性相关分析显示，PM-R中富集ASVs的四分之三（49/68）的相对丰度与至少一种特定的黄酮类化合物、香豆素及其衍生物呈正相关（图3e）。

图3 作物多样化对花生根际细菌群落的影响。

5.作物多样性增强的根际代谢物触发细菌固氮作用

正如研究团队所预期，根际细菌群落被不同种植系统中的生产和分泌的特定活性代谢物选择性影响。然而，目前尚不清楚为什么花生会改变其根际化学成分和微生物群。这可能与作物混合系统中展现出的较高植物氮固定能力有关。为了验证这一假设，研究团队从作物混合系统的花生根际中分离并培养出109种细菌，并在微板培养试验中测试了所选分离物对特定代谢物的反应（图4-5）。这些分离株属于五个门：厚壁菌门（54.1%）、放线菌门（19.3%）、γ-变形菌门（12.8%）、α-变形菌门（6.4%）和β-变形菌门（5.5%）（图4a）。研究团队筛选并纯化了27个分离株进行微板培养试验，其中包括四个隶属于假单胞菌和伯克霍尔德菌的菌株（N4、OP14、N68和N69），它们的标记序列与作物混合系统中富集的ASVs（ASV1、ASV335、ASV501、ASV1260）相似（图3d）。这四个代表性菌株中有三个（N4、N68和N69）能够在无氮培养基上生长，表明它们具有自生固氮能力。此外，研究团队还纯化了四个属于根瘤菌和慢生根瘤菌的分离株（N43、N45、N47和N59）。尽管这些菌株在系统发育上与作物混合系统中特定富集的ASVs不一致，但它们入侵和定植宿主的能力以及在花生根际的存在可能与作物混合系统中观察到的增加的宿主结瘤和根际氮有效性有关（图1）。最后，研究团队选择了19个其他物种的分离株，其标记序列与富集的ASVs不相似，作为对照组。

使用这27个菌株，研究团队进行了微板培养试验，以评估花生在混合系统中根际特异性富集的代谢物（槲皮素、金丝桃苷、莨菪亭和丁香醛）是否会影响细菌的生长率。平均而言，这些单个代谢物在含有5ug/mL的1/5 TSB培养基中，对48%的测试菌株的生长速率（V）产生了正面或负面的影响（图4b–e）。有趣的是，这四种代谢物对来自假单胞菌和伯克霍尔德菌的四个代表性分离株的生长率都没有负面影响。此外，对于这一组中自生固氮的细菌（N4、N68和N69），在添加代谢物的情况下，它们的氮固定能力与它们的生长率始终呈正相关（图4f–h）。

图4 来自PM-R花生根际的细菌分离物：典型代谢物对细菌生长率、自生N固定的影响。

与自生N固定菌对测试代谢物普遍的积极响应相比，四个根瘤菌分离株（即潜在的共生N固定菌）的生长率对这些黄酮类和香豆素类代谢物不敏感，甚至显示出负面反应，除了N43对莨菪亭和丁香醛有积极响应。考虑到作物混合系统中花生结瘤的大幅增加，研究团队假设在三种种植系统中，黄酮类物质及其衍生物的根际沉积增加增强了根瘤菌定植宿主根的能力，而不是它们的生长率。为了验证该假设，研究团队首先用单个N固定根瘤菌分离株（N43、N45、N47和N59）接种花生幼苗，发现只有慢生根瘤菌N47通过侧根基部入侵，在细胞内及细胞间定植，30天内成功诱导了花生宿主植物的结瘤（图5a）。因此，研究团队着重研究这个菌株，以评估根际富集的代谢物是否在共生关系建立过程中增加了结瘤信号。

研究团队向慢生根瘤菌培养物中添加黄酮类和香豆素物质，发现与对照相比，慢生根瘤菌的和基因表达量分别增加了21-126%和216-430%（图5b-c）。在模型微生物苜蓿根瘤菌（菌株1021）中，添加这些代谢物也观察到了对和相似的刺激效果。同时将这些代谢物添加到接种了慢生根瘤菌N47的花生幼苗中，与未添加代谢物的慢生根瘤菌接种相比，花生根中基因和在转录水平上的表达量增加了43-169%（图5d–f）。这些上调的植物基因通过编码富含亮氨酸的重复受体样激酶SYMRK、钙调蛋白依赖性蛋白激酶CCaMK和RWP-RK转录因子NIN，在结瘤器官发生中发挥着关键作用。因此，代谢物触发的细菌和根基因表达量增加最终导致接种和添加代谢物30天后结瘤数量增加了21-90%（图5g）。因此黄酮类化合物和香豆素是花生与慢生根瘤菌之间的化学通讯信号。另外一种代谢物丁香醛，没有这样的效果（图5b–g）。总的来说，这些结果表明在共存作物影响下产生的花生根际代谢物，增强了花生与慢生根瘤菌的共生关系，但不是生长率。

图5 典型代谢物对来自PM-R花生根际的细菌分离物N47定植的影响。

在自然和农业生态系统中，豆科植物和非豆科植物共生在可持续作物生产中发挥着关键作用。本研究发现，与无玉米间作的花生单一栽培和花生-油菜轮作相比，花生和玉米的间作，与油菜轮作的PM-R种植系统中花生生物量、根瘤和土壤N丰度显著增加。对花生根际土壤的代谢组检测表明，黄酮类化合物和香豆素是多样化种植系统下花生根际中增加的次生代谢物。花生根系转录组结果表明，苯丙素生物合成途径的激活，导致了PM-R种植系统中花生根际黄酮类化合物和香豆素的积累。另外根际土微生物组检测结果表明，豆科植物根际沉积物能够刺激土壤微生物群落的活性，增加土壤中固氮微生物的丰度和多样性。作物多样化诱导了花生通过特定根际代谢物沉积特异性选择固氮菌，而响应此类化学信号的固氮微生物变化最终决定了由寄主植物及其微生物群组成的共生功能体的根际功能。这种植物-微生物功能联盟及其相互适应性优势，为理解地上植物多样性与地下生态系统功能之间的关系提供了新的视角。

本文原文来自Bilibili