高通量筛选下，植物基因检测新方法如何“发光”发热？

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@小白创作中心

高通量筛选下，植物基因检测新方法如何“发光”发热？

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https://www.weichilab.com/news/827.html

随着生物技术的不断发展，转基因植物在农业、医药、环保等领域的应用越来越广泛。然而，如何准确、快速地检测转基因植物中的外源基因表达和功能，一直是科学家们面临的挑战。近日，日本的研究团队开发了一种名为Lumi-Map的高通量平台，该平台结合了基于孔板的荧光素酶 (LUC) 报告基因检测和突变图谱 (MutMap) 的技术，实现了对突变体的高效筛选和基因功能的快速鉴定，为我们揭示了拟南芥中参与病原体相关分子模式 (PAMP) 触发免疫的基因。

荧光素酶报告基因技术的工作原理

荧光素酶报告基因技术作为一种新型的转基因检测方法，具有操作简便、灵敏度高、实时监测等优点，一直是转基因研究中的重要手段。荧光素酶是一种能够催化荧光素氧化并产生生物发光的酶。在转基因植物中，将荧光素酶基因与目标基因的启动子或其他调控元件连接，构建成报告基因载体。当目标基因表达时，荧光素酶也会随之表达。通过加入荧光素底物，可以检测到荧光素酶产生的生物发光信号，从而间接反映目标基因的表达水平。

Lumi-Map技术的创新应用

近日，日本的研究团队开发了一种名为Lumi-Map的高通量平台，该平台结合了基于孔板的荧光素酶 (LUC) 报告基因检测和突变图谱 (MutMap) 的技术，实现了对突变体的高效筛选和基因功能的快速鉴定，为我们揭示了拟南芥中参与病原体相关分子模式 (PAMP) 触发免疫的基因。这一研究成果不仅为植物免疫机制的研究提供了新的思路，也为荧光素酶报告基因技术在转基因植物中的应用提供了成功的范例。

研究人员创建了9种转基因拟南芥报告系，该报告系中包含由防御基因启动子驱动的LUC基因。当植物受到PAMP（如flg22）处理时，启动子被激活，从而会产生生物发光。通过筛选24,000个经甲基磺酸乙酯 (EMS) 诱导的突变体，研究人员鉴定了22个在flg22处理后WRKY29表达改变的突变体（简称awf突变体）。与PAMP触发免疫相关的阿拉伯芥基因包括FLS2（鞭毛素感知受体），以及在研究中发现的其他三个未被之前关联的基因。通过结合Lumi-Map和MutMap，研究者能够快速识别出与PTI信号传导相关的致病突变。

Lumi-Map高通量筛选的具体流程

本研究中利用拟南芥的种子构建转基因植株，其后的Lumi-Map高通量筛选的流程如下：

种子处理：表面消毒后的种子在4°C黑暗环境孵育2天解除休眠；
播种：处理后的种子播至96孔微孔板，每孔加150 µl 半浓度液体MS培养基（含0.5%蔗糖和50 µM D-荧光素-K）；
光照和处理：连续光照培养7天促发芽，发芽幼苗用 0.5 µM flg22、0.5 µM elf18或1 mg/ml几丁质处理；
密封：用板封密封96孔板保持湿度防蒸发；
生物发光测量：用生物化学发光微孔板读板仪进行批量检测；
数据分析：用商业化软件 (SL00-01) 分析生物发光数据评估不同处理影响。通过这些步骤可有效测量幼苗在不同处理下的生物发光反应。

Lumi-Map技术的优势

在上述案例中，Lumi-Map技术的创新之处在于将实时荧光素酶生物发光筛选与MutMap技术相结合，实现了对突变体的高效筛选和基因功能的快速鉴定。

实时监测：Lumi-Map技术可以实时监测荧光素酶的生物发光信号，从而快速筛选出具有特定表型的突变体。这大大缩短了研究周期，提高了研究效率。
高通量筛选：该技术可以同时对大量的突变体进行筛选，为大规模基因功能研究提供了有力支持。
基因定位：结合MutMap技术，可以快速确定与特定表型相关的基因位点，为进一步的基因功能研究提供了重要线索。

得益于Lumi-Map技术平台提供的高通量检测效率，该研究团队在后续进行了更多植物抗病的研究，并在Science杂质上发表了研究论文，首次在拟南芥中发现马铃薯晚疫病菌的鞘脂的受体，揭示了植物识别病原体特有脂质的机制。

荧光素酶报告基因技术的其他应用

荧光素酶报告基因在转基因植物中还有很多其他应用：

基因表达分析：通过监测荧光素酶的发光强度，可以实时、定量地分析目标基因在不同组织、发育阶段或环境条件下的表达情况。例如，在研究植物对逆境胁迫的响应时，可以利用荧光素酶报告基因观察相关基因的表达变化。
启动子活性研究：将荧光素酶基因置于不同的启动子下游，构建成一系列报告基因载体，转化植物后可以分析启动子的活性。通过比较不同启动子驱动下荧光素酶的表达水平，可以确定启动子的强度、组织特异性和诱导性等特性。
蛋白质定位研究：通过将荧光素酶与目标蛋白质融合表达，可以利用荧光素酶的发光信号来确定蛋白质在细胞内的定位。例如，研究人员可以将荧光素酶与细胞膜蛋白、细胞器蛋白或核蛋白等融合，观察其在植物细胞中的分布情况。
信号转导研究：荧光素酶报告基因可以用于研究植物中的信号转导途径。例如，在研究植物激素信号通路时，可以将荧光素酶基因与激素响应元件连接，构建成报告基因载体。当植物受到激素刺激时，信号转导途径被激活，荧光素酶的表达也会随之改变。通过监测荧光素酶的发光强度，可以实时跟踪信号转导的过程，揭示信号转导的机制。

荧光素酶报告基因技术的优势

与传统的转基因检测方法相比，荧光素酶报告基因技术具有明显的优势：

操作简便性：传统的转基因检测方法，如 PCR、Southern blot、Northern blot 等，需要进行复杂的核酸提取、电泳、杂交等操作流程，既耗时又费力。而荧光素酶报告基因技术仅仅需要将报告基因载体转化到植物中，然后加入荧光素底物即可检测生物发光信号，操作简便快捷
灵敏度：荧光素酶报告基因技术具有极高的灵敏度，能够检测到极低水平的基因表达。
实时监测：荧光素酶报告基因技术可以对基因的表达变化进行实时监测，而传统方法只能检测某一特定时间点的基因表达情况。
空间分辨率：通过将荧光素酶与目标蛋白质融合表达，可以利用荧光素酶的发光信号来确定蛋白质在细胞内的定位，具有较高的空间分辨率。而传统方法无法提供蛋白质的定位信息。