红外光谱与傅立叶变换光谱（FTIR）：原理、应用与未来展望
红外光谱与傅立叶变换光谱（FTIR）：原理、应用与未来展望
傅立叶变换红外光谱（FTIR）技术凭借其卓越的灵敏度、灵活性、特异性和稳健性，已成为当下备受推崇的分析手段。该技术能够应对固体、液体和气体等多种形态的分析物，在食品与饮料、化学、工程、环境、制药以及生物质质谱等领域得到广泛应用。
什么是红外光谱？
人眼只能看到更广泛的电磁辐射光谱的一小部分（图1）。在可见光谱的高能量一侧是紫外线（UV）区域，而在低能量一侧是红外线（IR）。对有机化合物的分析最有用的红外区域往往是2500至16000 nm的波长。远红外、中红外和近红外（NIR）都包括在「分子光谱」的范围内。
图1 | 电磁波谱，插图显示红外光谱类型的典型子区域。
红外光谱技术，主要研究红外光与物质之间的相互作用，其特性在于红外光的波数范围涵盖了12800至10 cm-1的广阔领域。传统上，人们习惯于用“波数”来描述红外线的特性，因为波数与波长之间存在反比关系。这意味着波长较短的红外线拥有较高的波数，意味着在特定距离内能够容纳更多的波动。
根据波数的不同，红外线被进一步细分为不同的区间。远红外辐射通常指的是波数在500至20 cm-1之间的光波，中红外则涵盖了4000至500 cm-1的波数范围，而近红外则大致位于10,000至4000 cm-1之间。
红外线的吸收特性与其作用分子的结构密切相关。分子内部的原子间键合以及键尾原子的种类，共同决定了红外线在哪些特定频率下被吸收。红外区域的光子能量足以激发共价键原子发生振动。这些共价键可以被视为弹性极佳的弹簧，能够经历拉伸、弯曲、旋转和剪切等多种形变。
当分子吸收能量时，中红外辐射中的较高能量部分会激发分子的基本振动，使其从基态跃迁至第一振动态。相对而言，近红外光谱则主要由基本振动所产生的“泛音”组合带构成。这些泛音现象为研究者提供了深入理解分子内部结构和相互作用的独特视角。
什么是FTIR光谱，FTIR与红外光谱的区别是什么？
IR与FTIR之间的核心差异在于信号处理的方式。FTIR是基于干涉图构建的，这意味着光强度是干涉仪内部镜子位置的函数，而非传统色散仪器中波长的函数。这里的“FT”即指傅里叶变换，它作为将干涉图转换为波数函数强度的关键步骤。
通常情况下，当我们提及FTIR时，我们默认它主要在中红外区域工作。不过，值得注意的是，FT仪器同样适用于紫外和近红外光谱的测定。傅立叶红外与傅立叶近红外作为两种潜在互补的技术，在分析实践中，分析人员往往需要根据具体应用场景来选择使用哪一种，因此，了解它们的相对优势和局限性显得尤为重要。
相较于传统的色散仪器，傅立叶红外光谱的获取速度明显更快。此外，傅立叶变换法生成的光谱不仅展现出更优越的信噪比，而且其波长标尺经过高精度参考激光的校准，因此，在波长精度上也较传统红外光谱更胜一筹。
FTIR如何工作？
红外分光光度计是在十九世纪四十年代中期开发的。最初，它们的应用主要局限于有机化合物的研究工作，而且主要是在石油化工领域。这些最早的仪器是色散型扫描分光光度计（图2），速度很慢。
分散型仪器仍然存在，并在新的应用中找到了新的生命力，因为它们可以更容易地被小型化，而且制造成本更低，可以生产小型的、带有简单操作系统的掌上型仪器，在手机上运行。
图2 | 显示色散型红外分光光度计布局的示意图。
今天，大多数研究和开发级别的中红外仪器是FT型的。它们的发展可以追溯到十八世纪九十年代和Albert Michelson的工作，他在研究光速时发明了「干涉仪」，并因此获得诺贝尔奖。傅立叶变换红外仪使用一个干涉仪（图3），它由一个光源、分光器、两个镜子、一个激光器和一个探测器组成。
图3 | 显示干涉仪工作原理的示意图。
能量从源头到分光器，分光器将光束分成两部分。一部分被传送到一个移动的镜子，另一部分被反射到一个固定的镜子。移动镜以恒定的速度来回移动，由校准激光的反应控制。这两束光从镜子中反射出来，在分光器处重新组合，产生一个干涉图案，通过样品室（如果存在发生吸光度的样品）传送到检测器。这个信号然后被施加到FT函数中以产生一个光谱。
由此产生的干扰波形，称为「干涉图」，这部分内容我们将在后面将讨论，由FT仪器产生，编码了所有测量的波长的所有信息。然而，为了产生一个可解释的光谱，信号必须首先经过计算密集型的傅里叶变换数学函数。
1966年，Coey-Tukey算法的发展[6,7]提供了一个捷径计算，即「快速傅里叶变换」或FFT。这一点，加上第一批商业计算系统的出现，使得第一台商业FTIR，即FTS-14，于1969年9月上市[8]（图4）。
图4 | 显示FTIR光谱仪工作原理的示意图。数字表示下面讨论的傅立叶红外分析的步骤。
使用FTIR的分析过程如下。
- 源：红外能量从一个发光的黑体源发射出来，光束通过一个孔径，控制能量的大小。
- 干涉仪：红外光束进入干涉仪，如前所述，「光谱编码」在这里发生。干涉仪使用一个参考激光器进行精确的波长校准。
- 样品：红外光束进入样品室，通过样品表面或从样品表面反射；样品吸收特定频率的能量，这是样品的独特特征。
- 检测器：光束最终进入检测器进行最终测量。
- 计算机：信号被数字化，进行FFT计算，最终的红外光谱被呈现给用户。
傅立叶红外分析和收集傅立叶红外数据
现在有一系列的傅立叶红外仪器和多功能的可互换附件，使不同大小和形式的气态、液态和固态样品都能用同一基本仪器进行分析。值得注意的是，普通玻璃不具备中红外透射性，因此所有的仪器光学元件和采样附件都必须由其他合适的红外光学材料制成。
早期为固体样品开发的技术要求将分析物研磨并与可透红外的基质（通常是溴化钾（KBr））在高压下混合成一个小的固体透明盘。然后将这些样品安装在一个支架上进行透射测量。液体（不含水）样品通常在两个这样的红外透射盘之间形成薄膜，并有一个小间隔。这种方法的时间和可重复性都是问题。
在过去的30年里，越来越多的人采用替代方法，特别是现在无处不在的「ATR」（衰减全反射）技术。这种设备可以容纳少量的液体或固体样品放在一个晶体窗口上，不需要真正的样品制备，允许在几秒钟内收集光谱。当分析固体时，它们被一个顶部固定夹牢牢地压在晶体窗口上（图5）。
图5 | 使用ATR取样附件。
现在大多数公布的固体样品的应用都使用这种形式的设备。其他类型的装置，如用于漫反射的反射半球或气体样品密封池，也可用于特定的应用。甚至还有用金和其他红外兼容材料制成的96位微孔板，允许使用专门的FTIR附件装置进行高通量筛选[9]。
一个典型的操作模式（图6首先需要收集一个背景「空白」光谱。这将包含整个光束路径（光学和大气）的吸光度值。然后对样品进行分析，并从中减去空白光谱，得到样品特有的光谱响应。波数分辨率（通常为4到16 cm-1）和联合扫描（通常为8到64）都需要特定的应用优化，以达到可接受的信噪比平衡。
单独的扫描是快速的，在现代仪器上通常少于1秒，所以通过共同添加扫描和背景光谱减法，ATR设备上单个样品的分析工作流程可以在2分钟内完成。这使得FTIR-ATR特别适用于测量制造或筛选应用中的100或1000个样品，包括代谢组指纹分析[10]。
图6 | 制作典型光谱的工作流程。左边面板显示了样品和背景的干涉图，然后进行傅里叶变换（中间面板），用光谱减法来创建样品吸光度图（右边面板）。
如何解释红外光谱和FTIR光谱
傅立叶红外光谱具有丰富的信息，但这一事实可能使使用和解释它们具有挑战性。在这里可以找到一个解释傅立叶变换红外光谱的有用的入门读物。即使是一个简单的、纯的、单一的化合物样品，如香兰素（图7），也有一个多峰光谱。在这种情况下，与认证标准的库匹配方法可能会在单一成分的混合物中识别它，但在其他化合物的复杂混合物中，这将是不可能的。
图7 | 香兰素的傅立叶变换红外光谱，并标明了主要的峰的文号。波数（cm-1）在X轴上显示，与Y轴上的吸光度相对应。
问题是大多数有机物都含有碳（C）、氢（H）、氮（N）或氧（O）原子在单键或双键上的组合，因此相同的多个吸收峰在不同的化合物之间重叠。
仅仅试图用「眼睛」观察大量的光谱，试图判断它们所来自的样品是否或如何在某种程度上不同，然后迅速成为一个压倒性的挑战，即使对一个有经验的分析员来说也是如此。为了解决这个问题，FTIR数据经常与统计建模方法结合使用，如多变量分析（MVA），在化学方面通常被称为「化学计量学」。
傅立叶红外光谱数据非常适用于MVA技术，其核心是需要从每个样品中收集多个光谱并构建成一个数据矩阵。在这里，每一行是单个样品的完整光谱，每一列是所有样品中特定连续文号的对齐吸光度。
在这种形式下，像主成分分析（PCA）这样的技术可以应用于探索和可视化不同样品组的光谱反应之间可能的基于类别的关系，通过它们的分数图有效地进行。这给了样品差异一个直接的「可解释性」，而这是很难通过简单地叠加不同样品类别的光谱来衡量的。图8是一个PCA评分图的例子，显示了原始与加工的生物油样品的区别。
图8 | 生物油样品显示原始（红色）与加工（绿色）材料的比较。图中显示了傅立叶变换光谱（左）和衍生的PCA分数图（右）。
当定量是目标时（如浓度值），MVA方法，如部分最小二乘法回归，可用于建立基于定量值的化学浓度等属性的定标预测，使用先前从其他检测技术收集的每个样品成分的数据。然后将这些已知值输入算法计算，以确定与感兴趣的外部值最相关的光谱特征。
后一种方法非常受欢迎，因为如果计划和验证得当，它可以使FTIR有效地取代对新的未知样品（相同类型）的湿化学检测，节省时间和金钱。构建MVA模型的一个有用的结果是，除了样品图之外，产生的统计输出表可以确定在构建模型时使用的最重要的波长。从这个信息中，通常可以解释一些直接的化学见解。
傅立叶红外几乎总是被认为是「中」傅立叶红外。非FT中红外色散仪器不能产生这种宽光谱，因为扫描速度很慢，其功率（信噪比）差很多。然而，近红外有如此多的能量，非FT中红外色散仪器可以产生与中红外仪器类似的光谱。但是需要更长的时间，所以分辨率（测量的实际波数的数量）往往较低。
红外光谱图
下图（图9）显示了主要官能团（1500 cm-1及以上）产生的波段。处于中红外区域的500-1500 cm-1区域被称为指纹区，提供特定化合物特有的分子指纹，无法伪造。
图9 | 显示由主要官能团产生的红外带和每个化合物特有的指纹区的图表。
中红外与近红外/傅立叶光谱的优点、缺点和用途
中红外与近红外光谱在形状和结构方面存在显著差异。中红外光谱在有机物中展现出清晰、明确的光谱吸收带，使其成为结构阐释和化合物鉴定的理想选择。此外，多年来已积累了大量关于分子功能团在中红外区域的吸收特性的数据，这些数据在多个应用领域内发挥着重要作用。
有机分子对中红外辐射的吸收能力较强，因此即便使用少量样品材料（如几个粉粒）也能获得良好的光谱。然而，中红外光谱的一个主要缺点是它对水分的敏感性，即使样品中仅含有少量水分，也可能导致红外信号显著减弱。此外，由于有机物对中红外辐射的强烈吸收，光谱往往仅来源于样品表面的几微米深度，这可能限制了光谱的均匀性。因此，在进行中红外光谱分析时，需要更加谨慎地准备样品或进行重复分析。
近红外光谱则具有不同的优势。它对样品的化学和物理属性均表现出强烈的反应，使其在样品的整体品质评估中具有实用价值。由于近红外辐射在样品中的吸收较弱，因此可以实现更深的样品渗透。增加取样量可以提高近红外光谱的灵敏度，改善光谱的均匀性，并减少样品制备的复杂性。
然而，近红外光谱也存在一些局限性，特别是在化学特异性方面。大多数近红外分子反应表现为一阶或更高阶的泛音，这可能导致信号重叠，从而在一定程度上限制了其鉴别能力。然而，需要强调的是，中红外和近红外光谱的优势和劣势在很大程度上取决于特定的应用场景。因此，这两种技术都被广泛应用于不同的分析领域。
图10 | 典型的近红外（左）与中红外（右）光谱的例子。请注意，在中红外中可以分辨出更多的光谱特征。样品是干燥的蚊子，旨在识别疟疾病媒Anopheles arabiensis的脊椎动物血食。
傅立叶红外光谱仪：当前应用与未来展望
傅立叶变换红外光谱仪以其优越的设备成本、易用性以及丰富的信息输出，占据了光谱分析领域的独特地位。其高度的灵活性使得它在多个领域得到广泛应用，远超过本文所能详尽讨论的范畴。在制药和医疗领域，傅立叶红外光谱仪的应用正日益普及，为药物研发和医疗诊断提供了强大的技术支持。
近年来，一个引人注目的技术进展是基于傅立叶变换红外视频芯片（焦距阵列，即“FPA”）的化学成像技术的出现和快速发展。尽管自20世纪70年代以来，标准格式的FTIR显微镜已经问世，但它们通常采用单点红外探测器，因此任何成像都需要通过大量单一空间测量的拼接来实现。这样的成像过程耗时较长，即便是像1 cm²大小的切片组织，也可能需要数小时才能完成数据的收集。
然而，随着现代中红外成像芯片技术的突破，如常见的128 × 128像素阵列（也可达到更高的分辨率），成像速度得到了显著提升。这种高分辨率的阵列能够在单次扫描中生成高达16,000个具有空间分辨率的光谱数据，极大地提高了分析效率和准确性。
展望未来，傅立叶红外光谱仪的应用前景将更加广阔。随着技术的不断进步和成本的降低，傅立叶红外光谱仪有望在更多领域发挥重要作用，为科学研究和实际应用提供更为精准、快速和便捷的光谱分析解决方案。