血型微柱凝集法阴性而玻片法阳性,为何？
血型微柱凝集法阴性而玻片法阳性,为何？
血型鉴定是临床输血中的重要问题，患者住院时均需进行血型鉴定,特别是对于需抢救及输血的急危重患者而言,给予其输血治疗前必须要进行血型鉴定。而血型鉴定的准确性则是确保输血安全的重要保障。
血型系统是人类血型系统中最复杂且最具多态性的血型系统，其临床意义仅次于ABO血型系统。ISBT目前确认的Rh血型系统抗原达56个，其中D、C、c 、E和e 抗原均具有很强的免疫原性，是临床上产生同种免疫性抗体最常见的5种抗原。RhD抗原具有很强的免疫原性，其刺激机体产生的抗-Ｄ可以引起溶血性输血反应及严重胎儿新生儿溶血病。
病例介绍
患者林某，女，37岁，因月经不规则门诊就诊，常规进行血常规及血型等检测。采用微柱凝集法发现血型为AB型RhD阴性，另一位同事用玻片法发现血型为AB型RhD阳性。
实验室检查
- 微柱凝集法检测：患者ABO、RhD血型为AB型RhD阴性（见图1）。
- 玻片法复核：另一位值班人员使用玻片法复核血型发现患者ABO、RhD血型为AB型RhD阳性（见图2）。
- 盐水介质试管法检测：进一步用盐水介质试管法进行血型检测，发现患者ABO、RhD血型为AB型RhD阴性（见图3）。
- 基因分型检测：科室联系第三方检测公司进行了 RhD 基因分型、RhD 外显子测序。结果显示该患者血型荧光分型为RHD01N.01/RHD01N.01。综合以上实验检测结果，该患者血型表现型可能为D-；ccee。
检测方法比较
临床上常用的ABO 、Rh血型鉴定方式主要有两种, 一是试管法, 二是玻片法,两种鉴定方式均具有操作简单等优点, 因而逐被广泛应用于临床血型鉴定中。然而在实际的血型鉴定过程中鉴定结果极易受多种因素的影响，操作过程难于标准化。传统玻片法与MPT、MGT 相比其操作更简单快捷，但其极易受标本因素的影响，血清中蛋白异常增高、冷凝集素、过量纤维蛋白、血型抗原明显减弱、受污、抗原抗体比例不适当等皆可影响其检测结果，易出现假阳性或假阴性等情况。实验中使用的标准抗A、B 血清， 因血清效价水平不稳定等也会导致鉴定出现误差。因此在应用玻片法检测时，要注意红细胞与标准血清的比例。对可疑结果复检时用生理盐水洗涤红细胞2~3 次，延长37℃孵育时间，可以去除患者血清中的纤维蛋白和冷凝集素对血型检测的影响。在检测中要待血清与红细胞充分混匀并反应后才能观察结果， 凝集呈小颗粒状或不能明确判断的可疑结果，需用显微镜进行观察，以确保检测结果的准确性。
卡式微柱凝胶法属于免疫学检测技术，通过凝胶分子的筛选作用，利用离心力通过凝胶间隙分离凝聚红细胞，从而判读结果，具有操作简单，试剂、样本定量的优势，减少人为因素干预，提高准确性。Ｒh 血型可根据患者红细胞是否存在D 型抗原，分为阴性与阳性，有D 型抗原，则为Ｒh 阳性，其临床意义仅次于ABO 系统，对预防溶血性输血反应有重要意义。因此，有效鉴定患者ABO 血型及Ｒh 血型对患者输血安全有重要意义。卡式微柱凝胶法能够通过控制聚葡糖凝胶浓度调整分子筛孔径大小，并与系统调控的离心速度相配合，通过调整孔径大小，每次只允许1 个红细胞通过，更利于临床观察红细胞凝结情况，提升检测效果。相关研究显示，卡式微柱凝胶法相较于传统检验方法，可高出1 ～ 5 个滴度。同时卡式微柱凝胶法操作过程可标准化，定量试剂及样本，具有标记方便，结果易判读的优势，能够降低人为干预造成的误判，提高检测准确性。卡式微柱凝胶法的结果肉眼即可判断，且结果稳定，重复性较好，同时其标准化操作，减少样本用量，并可通过多次操作，提高检出率。
分子生物学检测技术对血型的准确鉴定具有重要作用，但是分子生物学技术存在检测环境要求高、检测成本高、检测用时长等局限性，因此该方法并不适合于患者的血型初筛或紧急输血的血型鉴定。为了提供准确的血型鉴定结果，最大程度保障患者的输血安全，应在考虑方法局限性的基础上恰当地采用分子生物学技术辅助血型鉴定。
RhD血型检测方案
目前的RhD血型检测技术已经成熟，但是对于初筛( 盐水法) 为RhD阴性的患者，其进一步RhD阴性确认试验的检测流程缺乏相应规范，如何合理地利用这些技术，对于不同受检人群，何时应用何种检测技术，对于不同的检测结果如何出具检验报告， 是临床输血工作者较为困惑的问题。此外，“亚洲型”DEL ( RHD* 01EL．01，c．1227G＞A)检测能力不足，也是目前临床面临的一大难题。解决上述问题，需要有合理的RhD血型检测策略支持，针对不同检测人群和个体，结合实验室自身条件，选择合适的检测策略，将对RhD血型检测和RhD阴性患者精准输血管理起到指导作用。
目前有以下检测方案：
检测方案 1：RhD血型初筛试验( 盐水介质法)
应用 IgM 抗-D 单克隆抗体，通过盐水试管法或微柱凝集法或微孔 板法完成RhD血型抗原初筛试验。
- 当检测结果为阳性，凝集强度≥3+，且自身对照为阴性时，报告检测结果为RhD阳性;
- 当检测结果为阳性，凝集强度＜3+，且自身对照为阴性时，报告检测结果为 RhD变异型( 待排查) ，可进一步进行 分子生物学检测;
- 当检测结果为阴性时，报告检测结果为RhD阴性( 盐水法) ;
- 当检测结果和自身对照均为阳性，则需要排除是否红细胞被抗体致敏所致，应结合实验室自身条件，采用适宜方法( 如 45℃热放散、巯基试剂、酸放散、ZZAP试剂等) 对阳性 红细胞进行放散试验，自身对照转为阴性后再重复试验。
检测方案 2：RhD阴性确认试验( IAT 技术)
对于初 筛试验结果为阴性的待检标本，使用至少 3 种不同来源单克 隆株的 IgG 抗-D 试剂( 如果单独 IgG 抗-D 试剂获取困难，也 可以使用 IgG+IgM 抗-D 试剂) ，通过微柱凝集 IAT 技术或试 管法 IAT 技术，完成 RhD阴性确认试验。
- 确认试验结果中若待检者红细胞直接抗人球蛋白试验( direct antiglobulin test，DAT) 结果为阴性，任何 1 种试剂检 测结果为阳性，报告检测结果为 ＲhD 变异型;
- 若 3 种检测试剂反应结果均为阴性，则报告检测结果 为RhD阴性( IAT) 。
- 如果待检者出现 DAT 阳性，则可能是红细胞被抗体 致敏导致，应结合实验室自身条件，采用适宜方法( 如45℃热放散、巯基试剂、酸放散、ZZAP 试剂等) 对阳性红细胞进行 放散试验，直抗结果阴性后重复试验，也可直接通过 ＲHD 基因分型技术明确其 ＲhD 血型。
检测方案 3：DEL 型鉴定( IgG 抗-D 吸收放散试验)
对于推荐方案 2 检测结果为 ＲhD 阴性( IAT) 的待检者，可首 先检测其 Ｒh 分型( 由于超过 99%的亚洲型 DEL 表型与 C 或 E 抗原阳性关联，实验室根据自身条件决定是否采用该方 法) ，如果 C 或 E 抗原阳性，可应用 ＲhD 阴性确认试验中使 用的 IgG 抗-D 试剂进行吸收放散试验鉴定其是否为 DEL 型。取 3 支洁净试管做好标记，分别加入压积红细胞( ≥200 μL)，大量生理盐水洗涤待检红细胞 3 次，在每支试管分别 加入等体积RhD阴性确认试验中使用的 IgG 抗-D 试剂，混 匀，37℃ 30 min，离心，弃掉吸收后上清，将压积红细胞转移 至新的洁净试管中，生理盐水洗涤 4 次，所得的压积红细胞 用于放散试验，放散方法采用化学放散( 如酸放散、氯仿放散 等) 。应用 IAT 技术检测放散液中是否存在抗-D。
- 若吸收放散试验检出抗-D，检测结果为阳性，则报告 为 DEL 型( 吸收放散) ;
- 若吸收放散试验未检出抗-D，检测结果为阴性，则报 告为 ＲhD 阴性( 吸收放散) 。
检测方案 4：RhD基因检测技术
对于检测结果为RhD变异型( 待排查) 、RhD变异型、RhD阴性( 盐水法) 、RhD阴性( IAT) 、RhD阴性( 吸收放散) 或 DEL 型( 吸收放散) 的待 检 者，实验室可根据自身条件和临床需求，通 过 PCＲ-SSP 基因分型、PCＲ-SSO 基因分型、ＲT-PCＲ 基因分型或 基因芯片基因分型等方法完成 ＲHD 基因分型检测，根据基因分型结果报告具体的 ＲHD 基因分型结果，如 ＲHD01N．01 ( RHD缺失) 、DEL( RHD 01EL．01，c1227G＞A) 等。
检测方案的选择和处理策略
首先应实施检测方案 1: 检测结果为 ＲhD 阳性 时，出具检验报告。检测结果为RhD阴性( 盐水法) 时，宜选 择进一步实施检测方案 2: 结果为RhD变异型时，出具检验报告; 结果为RhD阴性( IAT) 时，推荐选择进一步实施检测方案 3，必要时完成实施方案 4。也可以在检测方案 1或检 测方案 2 出现检测结果为RhD阴性( 盐水法) 或 RhD阴性 ( IAT) 时，根据情况直接实施检测方案 4，明确受检者的RhD基因型。
结论
在输血医学中，人类红细胞血型系统具有十分重要的意义，在人类已经发现的30多个红细胞血型系统中，Rh血型系统是国际输血协会( ISBT) 确认的红细胞血型系统中最复杂、最具多态性的血型系统，常见的抗原包括D、C、c、E、e 5 种抗原，其中D 抗原免疫性最强。可刺激机体产生的抗-Ｄ可以引起溶血性输血反应及严重胎儿新生儿溶血病。
2000年原卫生部发布的《临床输血技术规范》明确要求检测RhD抗原，但未规定检测Ｃ、ｃ、Ｅ、ｅ抗原。然而，当供者与受者ＣｃＥｅ抗原表型不合进行输血时常会导致相应同种抗体的产生。因此有条件的医院及血液中心在进行常规ABO/Rh血型鉴定时，可尽量开展Ｃ、ｃ、Ｅ、ｅ抗原检测及基因测序等，同时应加强与临床的沟通，保证输血安全。该患者存在生育要求，其血型的检测在预防输血反应和新生儿溶血病方面均有重要意义。采取合适的方法准确检测患者的血型，对患者的孕期管理具有重要的意义。
本文原文来自输血医视