人工金属酶的构建与优化：定向进化以及其他技术

人工金属酶的构建与优化：定向进化以及其他技术

随着化学工业的快速发展，对高效、选择性和多功能合成方法的需求不断增加。人工金属酶（Artificial Metalloenzymes，ArMs）作为一类将合成金属催化剂与蛋白质支架相结合的新型催化剂，近年来受到了广泛关注。本文综述了人工金属酶的构建与优化技术，重点介绍了定向进化在这一领域的应用进展。

随着对高效、选择性和多功能合成方法的需求不断增长，需要酶承担新的功能，表现出与当前化学催化方法相当或更好的活性和选择性，或填补合成化学的空白。本研究总结了非天然生物催化的现状，并描述了蛋白质工程如何实现创新，从而扩大酶可利用的化学空间。非生物酶功能的创造代表了一个不断发展的研究领域，需要来自不同领域的知识，包括蛋白质工程、酶学和合成化学。

在过去的几十年里，生物催化领域已成为现代合成研究的基石。定向进化的发展使我们能够利用酶的力量，这为生物催化的崛起奠定了基础。其总体目标是通过由三个阶段组成的迭代循环来加速理想性状的开发：(1) 基因多样化：生成目标酶的突变体库；(2) 选择：使用合适的方法选择具有所需表型的突变体；(3) 扩增：分离选定突变体的基因序列并将其用作下一轮基因多样化的亲本（图1）。

图1. 定向进化探索适应度景观以增强理想属性，为金属酶的设计和开发奠定了基础

自然界依赖于具有催化活性的金属蛋白（金属酶）在光合作用、氮固定、呼吸等生物过程中充当多功能催化剂。然而，天然金属酶的可用反应空间仅限于生物可利用的底物、金属和配体，因此催化能力相当有限。为了克服这些限制，人们致力于通过将合成金属催化剂与蛋白质支架相结合来制造混合催化剂。这开启了一个充满活力的研究领域，即“人工金属酶”（artificial metalloenzymes，ArM）。在蛋白质工程的进步的补充下，ArMs 已被开发用于催化 40 多种反应，其中许多反应在自然系统中没有等效反应，从而补充了经典的生物催化。蛋白质工程和计算设计的进步已经开启了重新利用天然金属蛋白和完全设计从头金属酶的能力。酶的重新利用利用了酶的混杂性质和强大的定向进化技术，通过使用化学直觉重定向催化来设计新的催化功能（图2）。

图2. 由重新利用的天然金属酶、从头设计的金属酶和人工金属酶催化的代表性非天然反应

定向进化策略

蛋白质工程的目标是改进目标蛋白质的期望特性，这通常被称为蛋白质的“适应性”（fitness），并通常被描述为一片需要探索的“适应性景观”，以达到“全局适应性最大值”。然而，由于蛋白质工程的本质，这一全局峰值可能永远无法达到。相反，许多工程项目会优化到一个主观上足够好的点，无论这个点是较高的催化转化数（TON）还是较高的对映选择性。关于这种主观性的讨论是值得关注的，但超出了本文的讨论范围；然而，考虑如何定义一次成功的突变实验仍然是重要的。因此，突变实验的终点被称为适应性峰值。人工金属酶（ArMs）将自身置于合成相关性的框架内，因此期望的特性通常与反应性和选择性有关。通常，有两种方法可以在适应性景观中导航。一种是利用高通量技术和易错突变快速评估蛋白质序列的广泛区域。另一种方法是通过蛋白质结构分析（如晶体学或计算技术）进行理性或半理性设计，并生成集中突变库。

通过提高通量来改善适应性

在探索大规模蛋白质空间时，筛选技术的通量常常是一个限制因素。在人工金属酶（ArMs）研究中，筛选技术通常用于识别起始物质向产物的转化。色谱技术其固有的缺点是分析时间较长，这在需要评估的大量残基时迅速成为限制因素。光谱技术提供了一种解决方案，因为通过微孔板读取器或荧光激活细胞分选（FACS），通量可以大幅提升。由于大多数化合物并不具有荧光特性，目前已开发出替代方案，如底物重新设计和功能基团（FG）测定法（图3）。

图3. 通过高通量、理性设计或结合两种技术来提高定向进化效率

尽管高通量技术在过去几十年中取得了优异的成果，但它们消耗大量资源，并且通常是偶然地发现有益的突变。这种方法类似于在适应性景观中漫无目的地行走，希望能找到一个局部适应性最大值。相比之下，携带一张地图可能会让我们更快、更高效地到达合适的局部适应性最大值。这种方法反映在通过蛋白质洞察生成的集中变体库的使用中。

文库设计：规划通往适应性峰值的路线

理性或集中文库设计提供了一种替代广泛筛选的方法。实质上，该策略围绕着理解蛋白质的结构-功能关系，并生成能够显著提升适应性的文库，同时覆盖最小的突变空间。然而，对于新型转化反应或开发新型人工金属酶时，可能关于影响性残基的信息有限，因此需要进行“热点识别”。丙氨酸扫描是一种广泛使用的技术，但该技术需要相当大的实验室工作量。计算分析蛋白质景观已成为识别热点的多功能工具。酶同源物的序列相似性和比对是一种计算上廉价的技术。此外，将辅因子或底物进行计算对接到活性位点中可以提供关于邻近残基的信息，这些残基可能对活性有显著贡献，可能影响结合、取向或活性位点的大小。一旦识别出这些残基，可以通过位点饱和突变（site-saturation mutagenesis）进行评估。随着机器学习技术的迅猛发展，计算指导设计在蛋白质工程中正在获得越来越多的关注（图3B）。

人工金属酶（ArMs）的创建与定向进化中的挑战与方法

虽然人工金属酶（ArMs）的优势显而易见，但其弱点也同样明显。ArMs（及其突变体）的有效性通常逊色于天然或重新利用的金属酶。这种差异归因于生成或进化ArMs过程中固有的几个独特挑战：

1. 合成金属辅因子在生物环境中的兼容性有限，抑制了它们的活性，并阻碍了使用细胞裂解液进行筛选测试的发展。
2. 细胞背景的复杂性导致将辅因子传递给宿主蛋白质的效率不高，这一问题由于缺乏适当的膜机械装置来正确转运非天然金属辅因子而进一步加剧。
3. 从未结合的金属辅因子中产生的高水平背景反应可能成为问题，需要额外步骤（如洗涤）来去除未结合的辅因子。这与天然辅因子形成对比，天然辅因子需要蛋白质骨架才能有效功能，因此背景反应最小。
4. 蛋白质骨架缺乏适当的腔体和多样性，限制了进一步定制和限制活性位点以实现所需的非生物反应的机会。

接下来的部分，作者通过详细讨论人工金属酶定向进化的最新进展，通过代表性的例子解决上述挑战，并阐明未来发展的新方向（表1）。

表1 通过工程改造与定向进化对重新利用、从头设计和人工金属酶进行改造，以实现自然界中未曾有过的催化功能

消除代谢物的有害影响

简化筛选流程

许多合成的有机金属辅因子与生物环境的相容性在许多情况下仍然是一个关键问题，珍贵的过渡金属催化剂在细胞碎片存在下通常表现出有限的活性或完全失活。为了解决这一难题，Ward等人证明了用硫醇氧化剂处理细胞裂解物 (cell-lysate，CL) 和无细胞提取物 (cell-free extract，CFE) 的有效性，可以中和硫醇对人工金属酶的有害影响。这种方法简化了微量滴定板形式的筛选过程，省去了蛋白质纯化的繁琐工作（图4）。

图4. 自然金属酶与人工金属酶（ArMs）在定向进化中的比较

天然金属酶在蛋白质表达过程中会自发地与辅因子组装，而 ArMs 中将合成的金属辅因子组装到细胞裂解物中的目标蛋白上的指定位点可能具有挑战性，因为宿主细胞蛋白和其他代谢物的大量存在可能会与指定的结合位点相互作用，从而阻碍辅因子锚定或导致不必要的二次偶联事件。为了克服这一挑战，Lewis等人通过创建了一种人工环丙烷酶的生物正交应变促进的炔烃-炔烃环加成组装。这种方法使得在 ArMs 进化中筛选随机突变 epPCR 文库成为可能（表1）。

在周质或细胞表面的区室化

绕过硫醇毒性、减少扩散障碍并提高筛选通量

近年来，通过在周质或大肠杆菌细胞表面表达蛋白质骨架并组装人工金属酶（ArMs），已取得了绕过细胞质中高硫醇浓度的进展（图5）。与细胞质系统相比，这些方法提供了三大优势。首先，周质环境具有氧化性，其中硫醇主要以氧化状态存在，形成二硫键。同样，细胞表面进一步被外膜、周质和内膜隔离，减少了与硫醇的接触。其次，将ArMs定位在周质或细胞表面有助于辅因子和反应物的接触。最后，这两种方法通常与全细胞筛选兼容，消除了细胞裂解的需求，并允许通过洗涤快速去除未结合的辅因子。

图5. 全细胞形式中ArMs定向进化的区室化策略

通过共表达辅因子转运体进行细胞质 ArM 组装

提高筛选通量并促进非自然生物合成

虽然将 ArMs 划分在周质和细胞表面具有显著的优势，但与细胞质系统相比，它也存在缺点。包括空间有限和支架蛋白的表达水平相对较低，在某些情况下，在细胞表面过度表达异源蛋白会对膜的完整性和细胞活力产生不利影响，从而阻碍 ArMs 的活性。另一个显著的缺点是 ArMs 与宿主细胞的代谢途径部分分离，这对开发结合 ArMs 和天然酶的体内/细胞并发级联应用提出了挑战。为了应对这一挑战，Hartwig等人展示了铱卟啉复合物与 CYP119 支架的体内组装，从而在大肠杆菌胞质内提供人工环丙烷酶，实现了环丙烷化产物的非自然生物合成。后来，该策略被用于 Ir-CYP119 的定向进化，用于催化卡宾对映选择性插入N-H键。与此同时，Roelfes等人报告了一种依赖于铜(II)-菲咯啉作为辅因子，以及乳球菌多药耐药调节因子（LmrR）作为骨架的细胞质自组装人工金属酶，通过定向进化，反应的活性和选择性显著提高（表1）。

剧烈的结构变化：限制和定制活性位点

引入单点突变通常不会导致深远明显的结构变化。插入或删除蛋白质片段以创建嵌合体或截断体是一种有效的策略，能够提供进化上的“飞跃”而非仅仅是逐步改进。嵌合结构提供了一个扩展的蛋白质空间，以保护人工辅因子，从而增强了人工金属酶（ArMs）的稳定性、活性和特异性（图6A）。作为原理证明，Ward等人将嵌合链霉亲和素（Sav）设计与定向进化相结合，显著提高了人工金属酶在转移氢化反应中的催化性能以及在氢化反应中的催化性能。

图6. 通过利用肽片段插入和非经典氨基酸引入以实现显著的结构和电子变化

由于经典氨基酸只能提供有限的多样性，在遗传密码中引入非天然氨基酸（non-canonical amino acids，ncAAs）开辟了引入辅助配体、生物正交锚定剂、光敏剂和氨基酸结构类似物的机会，并且这些非经典氨基酸可以提供创建人工金属酶的关键锚定点（图6B）。此外，金属离子的氧化态在其活性中发挥着至关重要的作用。因此，在设计高效的人工金属酶时，控制氧化还原电位和电子转移速率是至关重要的。调整还原电位、控制空间排列以及引入氧化还原伙伴可以显著影响反应结果。

未来与展望

如上所述，人们不断开发新的创新方法来改进定向进化过程，适应这些进步对于 ArMs 的持续发展和相关性至关重要。热点识别避免了对大型测序文库的需求，但缺少几个关键特征。首先，静态分析可能无法提供完整的图像；此外，缺乏有关上位性的信息是一个重大限制，开发纳入上位性重组的技术将极大地改变定向进化领域。基于选择的方法为评估大量蛋白质突变空间提供了强有力的替代方法。为了消除细胞环境的有害影响，人们努力将微流体技术应用于 ArMs 工程。并且无细胞蛋白质表达引起了人们的关注，已经开发了将其应用于 ArM 的相关工具。工程活动的重点是蛋白质的适应性，随着机器学习技术的出现和“坏”结果的新价值，通过将注意力从离散数字转移到景观如何变化以避免局部适应度最大值。最后，ArMs催化反应的制备价值经常被描述但很少被举例说明。如果 ArM 领域要获得更多认可，就应该努力通过证明合成效用来证明该领域的制备效用。

结论

定向进化推动了人工金属酶的发展，为非生物反应的开发提供了独特的平台。结合生物催化领域提供的创新解决方案，蛋白质骨架的设计和优化正变得越来越简单。然而，仍然存在许多挑战需要克服，机器学习和自动优化平台的兴起将使发现理想变体的过程最小化人工干预。人工金属酶的未来前景广阔，将继续为反应探索和发现提供一个充满活力和创造力的环境。