超氧化物歧化酶2在乳腺癌中的表达及其临床意义

超氧化物歧化酶2在乳腺癌中的表达及其临床意义

近年来，全球乳腺癌发病率持续上升，深入研究乳腺癌的发病机制，寻找能提高乳腺癌早期诊断的肿瘤标志物至关重要。本研究通过挖掘TCGA数据库，应用生物信息学方法分析SOD2在乳腺癌中的表达、临床相关性及生存预后相关性，并在临床样本中加以验证。研究发现SOD2在乳腺癌中的表达与TNM分期、腋窝淋巴结转移显著相关，SOD2可能通过调控IL10和/或STAT4介导JAK/STAT信号通路影响乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移。

研究背景

乳腺癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤之一，其发病率以每年增加0.3%的趋势上升。在中国女性中，乳腺癌新发病例占所有新发恶性肿瘤的15%，居首位，且发病率和死亡率均呈不断上升趋势。因此，深入研究乳腺癌的发病机制，寻找能提高乳腺癌早期诊断的肿瘤标志物至关重要。

前期研究通过TCGA数据库筛选出在乳腺癌组织中的差异表达基因超氧化物歧化酶2（SOD2）。文献报道SOD2在乳腺癌、肺癌、皮肤癌及涎腺腺样囊性癌中发挥抑癌作用，然而近期的研究表明，在卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌及食道癌中，SOD2发挥促癌作用，可能有助于肿瘤的进展和扩散。本研究通过挖掘TCGA数据库，应用生物信息学方法分析SOD2在乳腺癌中的表达、临床相关性及生存预后相关性，并在临床样本中加以验证。

研究方法

临床样本

从宁夏医科大学总医院生物样本组织库中提取2018年1月~2019年12月收集的原发性乳腺癌组织60例和相对应的癌旁组织60例为研究对象，60例患者均为女性，平均年龄48岁。所有患者均经术后病理诊断确诊为原发性乳腺癌，术前未行化疗、放射治疗或内分泌治疗。癌组织和癌旁组织均取自同一确诊乳腺癌患者，留取的乳腺癌组织和癌旁组织（距肿瘤组织边缘大于5 cm）均在离体30 min内放入液氮保存，收取标本时均告知患者留取标本将用于科研研究并签署知情同意书。

主要试剂

SOD2一抗、二抗、RNA提取试剂盒、RNA反转录试剂盒和Real time PCR Taqman试剂均由国内试剂公司代购（中杉金桥）。SOD2引物由上海吉凯公司设计并合成。

数据分析方法

1. 人乳腺癌基因芯片表达数据及临床数据的收集和处理
2. SOD2基因在人乳腺癌中的表达差异和临床相关性分析
3. 乳腺癌组织SOD2基因表达水平与乳腺癌预后的相关性分析
4. 基因集富集分析
5. PPI网络构建和信号通路关键基因筛选
6. SOD2与筛选出的信号通路关键基因的相关性分析
7. 免疫组化
8. RT-qPCR检测

研究结果

SOD2在乳腺癌和乳腺正常组织中的差异表达分析

基于TCGA数据分析结果显示SOD2基因在乳腺癌组织中的表达显著低于其在正常乳腺组织中的表达（P＜0.001，图 1A）。乳腺癌组织与其相匹配的癌旁组织中的表达分析也验证了SOD2在乳腺癌组织中的表达显著低于其在癌旁组织中（P＜0.001，图 1B）。

*图 1. TCGA数据库中SOD2基因的差异表达。A：乳腺癌组织和正常乳腺组织中SOD2的表达；B：配对乳腺癌组织和癌旁组织中SOD2的表达。*P< 0.001vsnormal.

然而在临床样本的检测中，发现SOD2 mRNA在乳腺癌中的相对表达水平明显高于其在癌旁组织的相对表达（P＜0.001，图 2D）。

*图 2. SOD2在乳腺癌组织及癌旁组织中mRNA的相对表达。A：RT-qPCR扩增曲线；B：熔解曲线；C：熔峰图；D：散点图显示乳腺癌组织和癌旁组织中SOD2的相对表达。Values are presented asMean±SD(*P< 0.001).

进一步的免疫组化结果显示，SOD2蛋白在乳腺癌中呈现高表达，而在癌旁组织中呈现低表达或表达缺失（P＜0.001，表 1，图 3）。

图 3. SOD2在乳腺癌组织及癌旁组织中蛋白水平的差异表达。A：乳腺癌组织；B：癌旁组织（原倍镜：×200）。

SOD2在乳腺癌中的的表达与临床病理特征间的相关性分析

基于TCGA数据库的数据分析结果显示SOD2的表达与乳腺癌TNM分期显著相关，Ⅲ、Ⅳ期患者中的表达明显低于Ⅰ、Ⅱ期（P＜0.05，图 4A）；与腋窝淋巴结有无转移显著相关，在有腋窝淋巴结转移的患者中其表达明显低于无腋窝淋巴结转移者（P＜0.001，图 4B）；而与T分期和有无远处转移无显著相关性（P＞0.05，图 4C、D）。

图 4. SOD2的表达与临床病理特征间的相关性分析。A：TNM分期；B：N分期；C：M分期；D：T分期。

通过临床样本SOD2相对mRNA表达做临床相关性分析，结果显示：SOD2的表达与腋窝淋巴结有无转移、雌激素受体（ER）表达及雄激素受体（AR）表达有显著性差异，P＜0.05。而与组织学类型、组织学分级、TNM分期、HER-2表达及Ki-67增殖无显著相关性。

SOD2在乳腺癌中的表达与乳腺癌患者的生存相关性分析

结果显示SOD2的高表达为乳腺癌一不良预后因素，在无复发生存、无远处转移生存和后进展生存期的分析中，SOD2高表达者的DMFS、RFS和PPS均显著低于SOD2低表达者（P＜0.05）。尽管在总生存的分析中未得到统计学差异（P=0.052），但SOD2高表达者OS低于低表达者的趋势存在。

图 5. 通过Kaplan-Meier Plotter数据库分析SOD2的表达与乳腺癌患者预后的关系。A：总生存；B：无远处转移生存；C：无复发生存；D：后进展生存。

SOD2调控信号通路GSEA富集分析

GSEA富集分析共有21个信号通路和生物过程在SOD2和乳腺癌之间具有不同程度的富集，FDR q-val＜0.05。其中与肿瘤相关的信号通路和生物过程有：细胞因子-细胞因子受体相互作用、Jak Stat信号通路、凋亡、P53信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性和趋化因子信号通路等。

图 6. GSEA信号通路富集分析。A：细胞因子-细胞因子受体相互作用；B：Jak Stat信号通路；C：凋亡；D：P53信号通路；E：自然杀伤细胞介导的细胞毒性；F：趋化因子信号通路。BRCA：乳腺癌；ES：富集分数；NES：标准化ES；NOMP-val：标准化P值。

SOD2在JAK-STAT信号通路中的蛋白互作网络分析

GSEA富集分析显示SOD2在JAK-STAT信号通路中发挥重要的生物学作用（图 7A），通过cytoscape软件构建SOD2在JAK-STAT信号通路中关键基因的蛋白互作网络，其中IL10和STAT4与SOD2最具有相关性，为筛选出的Hub基因（图 7B），进一步对筛选出的IL10和STAT4与SOD2做相关性分析，二者均与SOD2呈正相关性，相关系数分别为0.35和0.38，P＜0.001（图 7C、D）。

图 7. SOD2在JAK-STAT信号通路中蛋白互作网络。A：KEGG富集分析气泡图；B：PPI网络中的关键基因；C：TCGA数据库中SOD2与IL10的相关性分析；D：TCGA数据库中SOD2与STAT4的相关性分析。

讨论

SOD2在肿瘤进展过程中的作用已有数十年的研究并引起争议。传统上认为SOD2是一种肿瘤抑制因子。然而，有些研究报道在肿瘤的转移过程中，SOD2的表达会升高，这使肿瘤细胞能够应对增加的细胞核细胞外氧化还原应激，SOD2的表达同样通过其作为氧自由基清除剂的典型作用为肿瘤细胞线粒体提供了保护。

为了进一步研究SOD2在乳腺癌中的功能及调控机制，利用TCGA数据进行了KEGG的基因集进行基因富集分析，富集分析发现，在乳腺癌中共有21个信号通路和功能在SOD2的高表达表型中有显著意义的富集，其中与肿瘤有关的有：细胞因子-细胞因子受体相互作用、JAK/STAT信号通路、凋亡、P53信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性和趋化因子信号通路等。

结论

本研究通过挖掘TCGA数据库，应用生物信息学技术推测SOD2可能作为潜在的诊断乳腺癌和预测其预后的肿瘤标记物，其内在的调控机制可能是通过调控IL10介导JAK-STAT信号通路影响乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移，尚需要进行一系列的实验来验证我们的预测结果，为乳腺癌的早期诊断和疗效评估提供新的靶点。

本文原文来自NCBI