液相色谱选择性优化：流动相、色谱柱、压力与温度的影响
液相色谱选择性优化：流动相、色谱柱、压力与温度的影响
在液相色谱分析中，选择性优化是一个关键问题。本文将介绍影响选择性的各种因素，包括流动相类型、洗脱强度、色谱柱类型、压力和温度等，并提供具体的实验建议和优化方法。
流动相类型
在液相色谱中，流动相的选择对分离效果有着重要影响。流动相的酸碱性和偶极特性是决定选择性的主要因素。为了直观显示这些性质，可以使用溶剂选择性三角形。在这样的三角形中，顶点是三种具有100%碱性、100%酸性和100%偶极性的理想溶剂。虽然现实中不存在这样的理想溶剂，但可以通过混合甲醇、乙腈和四氢呋喃等实际溶剂来接近所需的性质。
图 1. 溶剂选择性三角形
流动相洗脱强度
改变流动相洗脱强度是一种更容易改变色谱峰保留的方法。通常这种方法足以分离色谱峰。不过，与改变流动相类型相比，改变流动相强度对选择性的影响较小。因此，当改变流动相的洗脱强度后仍无法分离色谱峰时，建议改变流动相类型。保留因子的变化与 %B 的函数关系如下式所示：
在进行等度分离时，建议先使用高比例的有机相，然后以 10%B 的比例递减。利用三倍原则（即 B 相变化10%，保留时间大约变化三倍）检查相邻色谱峰之间分离度，有助于预测最佳条件。需要注意的是，由于分析物的 S 值不同，φ 变化时可能会出现峰交叉。
色谱柱类型
改变色谱柱化学成分是改变选择性的有力工具。选择性的差异可能来自硅胶载体材料、键合相的化学成分，或两者兼而有之。在相同类型的硅胶上试用同一制造商生产的不同键合相的色谱柱时，选择性的差异取决于键合相化学性质的不同，因为硅胶颗粒的化学性质应该是相同的。
如果选择性差异较大，则应通过更换制造商和键合相来有针对性地改变硅胶载体类型和键合相。比较数据库（http://www.hplccolumns.org/ database/index.php 和 http://apps.usp.org/app/USPNF/ columnsDB.html）中提供的色谱柱属性，是选择相似或不同选择性色谱柱的更系统方法。这些数据库包含近 700 种固定相，并提供了一种根据 Fs因子（即选择性差异因子）比较固定相选择性的方法。
表 2. 根据公式(2) 从疏水性差异评估模型计算出的FS因子
两个色谱柱的 Fs因子根据公式(2)计算。公式中的常数是根据 "平均 "组成的 67 种成分样品确定的权重系数。这些常数描述了平均样品中每个色谱柱参数的相对重要性。随着 FS因子值的增加，两个色谱柱之间的选择性差异也会增加。表 2 列出了四个色谱柱的 FS系数计算示例。FS值为 3 或更小的色谱柱被认为是等效色谱柱，匹配度极高。随着 FS值的增加，两个色谱柱的选择性差异也随之增大，直到 FS值达到 50 时，两个色谱柱被认为是正交的。
图2中的雷达图是一种用于理解五维空间中色谱柱比较的可视化工具，它展示了色谱柱选择性差异的基础。
图2 基于疏水差异评估模型参数，四根色谱柱选择性比较雷达图。雷达图的中心点表示：数据库中观察到的某参数的最小值，而顶点对应该参数的最高可能值。
例如，Acquity BEH Shield RP18 和 XBridge BEH C18 的 FS值表明这两种色谱柱具有不同的选择性，但没有进一步详细说明哪些参数不同。不过，雷达图显示，选择性的差异主要是由于氢键碱性参数不同造成的。
与上述比较相反，XBridge BEH C18 和 Kinetex Biphenyl 之间选择性的差异是由不止一个色谱柱参数的差异造成的。当分析人员了解相邻分析物的物理化学特性时，这种图谱有助于选择合适的色谱柱（例如，如果相邻色谱峰中有一个分析物具有氢键给体点，则应选择氢键受体（B）能力强的色谱柱，如 Zorbax Bonus RP。
其中，H 指色谱柱的疏水性，S* 指空间位阻，A 指氢键酸性，B 指氢键碱性，C 指阳离子交换活性。下标 1 和 2 指比较的两个色谱柱。
压力
以不同流速（即相同流速×时间）运行等效梯度时，可观察到压力对选择性的影响。在这种等效梯度下，色谱峰相对保留时间的变化表明压力的变化导致了选择性的变化。
压力对选择性影响的解释并不直截了当，因为流速的增加伴随着摩擦热的增加。因此，温度对选择性也有影响。在反相色谱中，所有分子的保留率都会随着压力的增加而增加，极性分子和离子化分子受到的影响更大。
压力对选择性的影响随着键合相链长度的增加而增大。流动相的水/有机物比率会影响压力-选择性效应的大小。观察结果与压力改变时溶质分子体积的变化一致。需要注意的是，改变压力来调整选择性并不实际，也不像改变色谱柱类型、溶剂强度或溶剂类型那样简单。
温度
温度是改变选择性的有效方法，尤其是对于离子型化合物。温度的变化会导致 pH 值的变化，从而改变电离程度。因此，改变温度与改变 pH 值具有相同的效果。对色谱柱温度进行微调（1~2°C）可用于调整缓冲液制备过程中的微小误差。温度的变化可能会导致保留时间、选择性或峰形的变化。可能会出现综合效应。温度升高，运行时间缩短，峰形变窄。
