PCR温度梯度功能介绍

PCR温度梯度功能介绍

PCR（聚合酶链式反应）是一种在体外扩增特定DNA片段的技术。其基本原理是模拟DNA的自然复制过程，在体外利用DNA聚合酶实现DNA的快速扩增。

PCR反应体系

• 模板：待扩增的核酸片段。
• 引物：人工合成的寡核苷酸，用于启动DNA合成。
• dNTPs：四种脱氧单核苷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）。
• DNA聚合酶：如Taq酶，在高温下保持活性，催化反应的完成。
• Mg²⁺：稳定DNA聚合酶的活性。

PCR反应原理

PCR的基本原理是基于DNA的变性、退火和延伸三个步骤的循环过程：

1. 变性：通过加热使双链DNA解开成为两条单链，温度通常在95℃左右。
2. 退火：降低温度至55-70℃，使引物与单链DNA模板上的互补序列结合。
3. 延伸：在适宜的温度下（72℃左右），DNA聚合酶以引物为起点，合成新的DNA链。

这三个步骤构成一个循环，每完成一个循环，DNA的数量就会翻倍。经过多次循环，可以获得大量的目标DNA片段。

建立一个成熟稳定的PCR反应所需要的条件：

• 完整且纯净的模板（胶图和nanodrop测值评价）
• 高特异高品质的引物（引物设计软件评分）
• 组分搭配适宜的反应体系（比如针对模板的GC比，是否考虑添加DMSO或甜菜碱；高保真或高得率应添加多少镁离子）
• 合理的扩增反应程序（在引物Tm值附近进行多次实验摸索最佳退火温度）

确定合理的扩增反应程序与PCR仪直接相关。如果PCR仪具备温度梯度功能，则可以通过设置不同的温度梯度来降低实验次数，快速确定退火温度。

柏恒梯度PCR仪（RePure系列）的温度梯度功能

常规梯度

单向的首尾两端设定退火温度范围的低值和高值，中间孔位则渐进分布温度，但首尾之间的孔位不一定呈现等差温度分布。

线性梯度

单向的中间设定一个温度，再设定一个相邻孔位的温差，设定温度会按照温差向两边扩散。相邻孔位的温度严格按照温差生成，可验证所感兴趣的整数温度。纵向生成4个（8孔），横向生成6个（12孔）。国产品牌只有柏恒具备此功能。

线性梯度优势：

• 同时进行多个不同退火温度的PCR反应，一次实验就能确定体系最优的退火温度，缩短验证周期提高实验效率。

二维梯度

反应模块的纵向、横向可以同时设置常规/线性梯度。使反应模块形成一个变性/退火均在不同温度下反应的阵列，通过一次反应摸索出最佳的变性/退火温度组合。

二维梯度优势：

1. 提高PCR反应的特异性：在二维梯度温度下，引物与模板结合能力的变化，可以使反应具有更高的特异性并减少非特异性杂交产物的产生。
2. 提高PCR反应的产物纯度：通过对反应中各分子靶点进行优化，以使放大的DNA产物得到放大。
3. 检测基因点突变：根据已知的突变位点设计适当的引物，通过PCR扩增得到目标基因的片段，然后对扩增产物进行测序，检测突变位点。
4. 检测种群间的遗传多样性：通过二维梯度PCR扩增，产物进行测序，发现突变位点，比对种群间的遗传物质多样性。
5. 操作简单：二维梯度PCR仅仅需要配置一个反应体系即可。
6. 提高阳性检测准确性：二维梯度PCR一次性就可得到96种温度组合，大大减免了样品简单的交叉污染，降低了假阳性出现的几率，进而提高了真阳性的检测准确性。
7. 缩短实验时间：由于二维梯度PCR可以根据温度的不同，优化出最佳反应温度，缩短了多次探索变性温度或者退火温度的时间。

独立6温区

相邻温区可设置温差不超过5℃的温度同时进行退火温度的摸索，每个温度分区下有16孔可作为复孔位。独立的6个温度分区可以按照等差设置温度也可根据需要灵活设置每个分区的温度。相当于线性梯度的升级版。

同时，柏恒梯度PCR仪均采用前进风后出风的散热模式，即便多台PCR仪并排放置或在台架上密集摆放，也不会因旁边仪器的散热风影响控温的准确性。