重组胶原蛋白下游纯化方法概述
重组胶原蛋白下游纯化方法概述
胶原蛋白是生物体内重要的结构蛋白，广泛应用于医药、生物材料及美容护肤等领域。随着重组胶原蛋白技术的发展，其下游纯化工艺成为关键环节。本文详细介绍了重组胶原蛋白的三种主要纯化方法：亲和层析、离子交换层析和沉淀法，并结合具体案例阐述了这些方法在实际应用中的效果。
胶原蛋白 (Collagen) 是细胞外基质 (extracellular matrix) 的主要成分，广泛分布于动物结缔组织、韧带、跟腱等部位，其含量占生物体自身总蛋白的30%左右[1]。从结构上看胶原蛋白由3条肽链通过氢键相互缠绕构成三股螺旋结构（图1. A），每条胶原肽链主要由Gly-X-Y（X和Y常为脯氨酸和羟脯氨酸，少数为赖氨酸和羟赖氨酸）三联体重复构成。三螺旋构象稳定过程中羟脯氨酸的羟基能形成强氢键，提高胶原蛋白强度；脯氨酸和羟脯氨酸能使胶原三螺旋结构发生扭曲进而提高胶原蛋白的稳定性[2,3]。这种三螺旋结构决定了胶原蛋白具有优良的生物相容性，低免疫原性和可降解性等多种优点，可以广泛应用于在食品、医药、生物材料及美容护肤领域。
图1：胶原蛋白结构示意图 (A) 标准纤维胶原蛋白组成；(B) 包含非三螺旋结构的三螺旋纤维胶原蛋白，非三螺旋结构（蓝色小球位置）与胶原蛋白形成更大的复合结构相关；(C) 胶原蛋白三螺旋晶体结构；(D) 胶原蛋白三螺旋空间结构[4]
目前胶原蛋白获取方法包括：天然提取法、化学合成法和基因工程法（重组胶原蛋白）。
天然胶原蛋白原料主要来源于陆生动物和水生生物加工后的副产物。陆生动物源胶原蛋白主要指从猪、牛的皮和骨中提取的胶原蛋白；然而，由于疯牛病、口蹄疫等牲畜疾病的存在，导致此类胶原存在人兽共患病的风险。
化学合成法获得的胶原蛋白在某些生物材料应用中改性较差，易致病和产生免疫排异反应。近年来改进的化学合成法产生的三螺旋胶原蛋白，虽然解决了免疫排异和病毒隐患的问题，但是合成的技术比较复杂，成本较高，且无生物活性，主要用于实验室研究[3]。
重组胶原是将人源胶原DNA经合适的宿主表达并翻译的蛋白或者类似胶原蛋白的多肽，相对于天然提取胶原，重组胶原蛋白具有质量稳定、组分可控、生物安全性高和可编辑修饰等优点（表1）[5]。
表1：重组胶原蛋白与天然胶原蛋白的特性对比[6]
基因工程技术生产的胶原蛋白称为重组胶原蛋白，基于人胶原蛋白的特征和主要功能域重新优化设计基因序列，然后通过选用各种宿主细胞进行表达（图2）。不同宿主表达系统具有不同的特点。
其中，植物细胞的发酵培养难度大、纯化成本高且产量低，不适宜于大规模生产，一般用于实验室研究；
微生物培养及发酵成本较低，遗传背景清晰，操作性强适宜工业化生产，但也生物学活性低、有内毒素、缺乏使胶原蛋白三螺旋结构稳定的羟基化酶等问题；
动物细胞表达系统适合表达复杂大分子蛋白、蛋白活性高且带有正确高级结构和修饰，但是也存在培养技术难度大培养成本高等问题（表2）。
因此胶原蛋白的表达需要依据具体实验目的与实验条件选择合适的表达系统。
图2：基因工程方法获取重组胶原蛋白路径示意图[7]
表2：重组胶原蛋白不同表达系统优势、劣势比较[8]
从纯化方法看，目前重组胶原蛋白的分离纯化主要使用沉淀、过滤和层析等方法，本文以下对重组胶原蛋白的分离纯化过程中的常用方法进行具体介绍。
亲和层析
亲和层析是基于目标蛋白与亲和配体间可逆的相互作用，实现目标蛋白与杂质蛋白分离，进而达到纯化目标蛋白的目的（图3）。亲和层析方法在重组胶原蛋白纯化过程中有着广泛应用。
图3：亲和层析纯化重组胶原蛋白步骤图示[9]
Rutschmann等使用大肠杆菌表达系统表达重组人Ⅲ型胶原蛋白，重组胶原蛋白带有His标签因此使用HisTrap Ni Sepharose 6 FF (Cytiva) 预装柱进行纯化，纯化得到了纯度较高的重组胶原蛋白（图4），其蛋白收获量达到90mg/L。进一步分析发现该方法纯化获得的重组胶原蛋白理化性质与人体内天然胶原蛋白的性质高度一致[10]。
图4：重组胶原蛋白纯化结果（L表示细胞裂解液，P代表Ni亲和层析纯化后蛋白；左侧为考马斯亮蓝染色，右侧为Anti-His Western blot显影）
离子交换层析
离子交换层析是在一定pH条件下，利用不同蛋白所带电荷的差异与填料配基之间存在特定电荷间相互作用，达到对不同蛋白分离的目的。离子交换的方法在重组胶原蛋白的纯化过程中也有着非常多的应用，Liang等使用毕赤酵母表达重组人Ⅲ型胶原蛋白，30%硫酸铵沉淀后使用阳离子SP Sepharose High Performance (Cytiva)一步离子交换层析完成纯化（图5）；作者采用该工艺对60 L发酵液进行纯化，最终得到毕赤酵母表达重组人Ⅲ型胶原蛋白纯度97.7%，胶原蛋白总回收率68.8%[11]。
图5：SP HP阳离子交换层析线性洗脱结果 (A) 重组人Ⅲ型胶原蛋白 SP HP层析图谱；(B,C) 重组人Ⅲ型胶原蛋白SP HP纯化SDS-PAGE电泳结果，泳道数字为分步收集样品编号
沉淀法
沉淀法是分子生物学下游纯化常用的方法之一，具体到胶原蛋白纯化过程中主要使用盐沉和酸沉两种沉淀方法；沉淀法纯化胶原蛋白需要与其他方法（如层析、胃蛋白酶消化、超滤等）配合使用。Werkmeister等使用酸沉淀和蛋白水解的方法去除样品中的宿主蛋白，之后使用切向流过滤方式（10 KDa TFF膜包，Pall Life Sciences）收集胶原蛋白（图6）；该方法操作简单、可放大，而且过程中不涉及层析操作，最终获得胶原蛋白纯度大于95%，总收率大约为71%[12]。
图6：沉淀法纯化重组胶原蛋白过程流程图示[12]
总结与讨论
胶原蛋白不同纯化方法之间不是孤立与排斥的，在重组胶原蛋白的纯化过程中经常是多种纯化方法相互配合，共同完成胶原蛋白纯化的目标。对于含有标签的重组胶原蛋白，一般使用亲和捕获，再使用离子交换进行精纯，最后使用TFF进行浓缩换液；对于不含有标签的重组胶原蛋白可以使用沉淀法去除部分宿主蛋白，再使用离子交换处理，最后对样品进行浓缩换液。工业领域的胶原蛋白纯化方案需要结合产品质量、生产效率和生产成本等多方面因素综合考量，Cytiva在工业规模胶原蛋白纯化方面积累了丰富实践经验，可以给客户提供可靠的工艺路线；胶原蛋白纯化工艺相关问题可以联系Cytiva进行咨询。
最后，需要说明的是为了避免亲和标签影响蛋白功能，含有标签蛋白亲和捕获后，通常需要添加去除标签步骤，该步骤由于受到相关酶切效率的影响往往存在酶切时间长，酶切效率低等问题，进而影响重组胶原蛋白整体纯化效率。为了应对亲和层析存在的以上问题，Cytiva推出了具有自剪切能力的亲和填料Protein select，该填料实现了亲和层析与标签切除同步完成，极大地提高了亲和步骤纯化效率，可以作为重组蛋白纯化的理想填料选择之一。