影响色谱分离的因素之——关于流动相不得不了解的基础知识
影响色谱分离的因素之——关于流动相不得不了解的基础知识
高效液相色谱（HPLC）作为一种重要的分离分析技术，在化学、生物等领域的应用日益广泛。流动相作为影响色谱分离效果的关键因素之一，其选择和优化对获得理想的分离结果至关重要。本文将系统探讨流动相的相关参数，包括溶剂强度和选择性，并介绍Snyder溶剂选择性三角理论在流动相优化中的应用。
一、流动相关键参数——溶剂强度
溶剂的洗脱能力与极性密切相关，正相色谱中溶剂的极性越强，洗脱能力越强；反相色谱中，溶剂极性越弱，洗脱能力越强。
2.1 溶剂极性参数
溶剂极性参数P′是斯奈德（Snyder）在罗胥纳德（Rohrschneider）溶剂分配系数基础上提出的，选择乙醇、二氧六环、硝基甲烷为参照物质，通过测得溶剂分配系数Kg校正溶剂相对分子质量和体积的影响，得到每种溶剂校正后的溶剂分配系数K″g，来度量分配色谱的溶剂强度。具体公式如下：
注：e、d、n分别代表乙醇、二氧六环、硝基甲烷
使用3种参考物质的分配系数，分别定义了溶剂的质子受体参数Xe、质子给予参数Xd、强偶极参数Xn。
表1 常用溶剂的极性参数
极性参数P′值越大，则溶剂的极性越强，在正相色谱中的洗脱能力越强。
2.2.洗脱强度因子/因数
洗脱强度因子也是一种评价溶剂洗脱能力的参数，主要用于反向洗脱的溶剂系统。洗脱强度因子用S表示，与正相洗脱的P′大致相反，比如正相洗脱时水的洗脱能力最强（P′最大为10.2），而在反相洗脱时，水的洗脱能力最弱（S最小，为0）。
表2 反相色谱中常用溶剂的强度因子
2.3多元溶剂的强度
多元溶剂的强度参数具有加和性，其值为各种组成溶剂极性参数的加权和：
注：
为各组分的极性参数；
为各组分的体积分数
反相色谱中的溶剂洗脱强度因子也有类似加和性：
注：
为各组分的强度因子；
为各组分的体积分数
不同的溶剂混合可得到相近的洗脱强度，相同的洗脱强度并不一定能获得相同的分离效果。为使混合物各组分能以合适的保留被洗脱，又要求各组分能够被分离，一般控制容量因子在110之间，复杂体系可放宽到120。通过调节溶剂配比可联系改变溶剂的洗脱强度，从而改变组分的容量因子。然而溶剂强度是粗略预测溶剂对溶质保留效果的色谱参数，溶剂的选择性是另一个影响色谱分离的较为复杂的因素。
三、流动相关键参数——溶剂的选择性
3.1 溶剂选择性三角
Synder依据溶剂选择性参数质子受体参数Xe、质子给予参数Xd、强偶极参数Xn建立溶剂的选择性三角。
表3 Synder溶剂选择性分组
Ⅰ组溶剂Xe值较大，属于质子接受体溶剂；Ⅴ组溶剂Xn值最大，属于偶极中性化合物；Ⅷ组溶剂的Xd值较大。处于同一组种各溶剂的作用力类型相同，在色谱分离中有相似的选择性，而处于不同组别的溶剂，其选择性差别较大。
Synder溶剂选择性三角形被公认为色谱常用溶剂分类的基本方法。1993年，Synder根据酸性物质、碱性物质和两性物质为参比，重新研究溶剂选择性三角形（见下图），其中小三角的三个顶点醇、腈类和四氢呋喃常用作反向液相色谱种首选溶剂。
3.2选择性三角的使用
在Snyder溶剂选择性三角形基础上，较多的三角形法可用于流动相体系的选择。
根据溶剂选择性分组，选择具有显著选择性差异的溶剂作为流动相，反相色谱中常选择甲醇、乙腈和四氢呋喃，以水为底剂；正相色谱中常选择乙醚、氯仿和二氯甲烷，以己烷或戊烷为底剂。
选择溶剂的过程就是在三角形上寻找优化流动相组成，使达到理想的分离。下图以反相色谱为例，选用3种差别性较大的溶剂甲醇、乙腈和水，作为三角形3个顶点。任何2种组分连线上的点表示2种组分混合物，三角形内部所有点则代表3种组分的混合物；图中1、2、3号点分别代表1:1的甲醇与水、水与乙腈、乙腈与甲醇的混合物，4号点代表甲醇-乙腈-水比例为1:1:1所构成的流动相。
试验发现（a）图阴影部分为色谱分离的较优区间，则依据上述原理继续选择（b）图中5、6、7、8号点对应流动相比例继续试验，直至获得最优的溶剂比例。
同样的三角形还可用于设计四元溶剂体系的选择。先选择3种选择性差别大的溶剂，再选择一种调节极性的溶剂，分别与上述3种溶剂组成3个等洗脱强度的二元混合溶剂，依照图3所示模式进行试验，确定最优流动相体系。不难理解，该方法设计的三角形各点溶剂强度基本一致，不同配比的选择性必然不同，可用于分析各组分保留相差不大的混合物。因此三角形法提供了配制强度相同而选择性不同的流动相体系的方法。
四、小结
应当注意的是以上方法都是基于等度洗脱，通过实验获得分离性能相对较好的溶剂体系，并不能预测组分的保留，也不一定获得可接受的分离效果。基于上述模式使用计算机系统建立数学模型进行系统的优化，已获得充分的验证，并已实现商业化。对于性质差异较大的多组分复杂体系，往往通过梯度洗脱或其他手段才能获得可被接受的分离效果。
然而Snyder溶剂选择性三角形理论在实际工作中仍起到至关重要的作用，与溶剂强度（极性参数）理论，构成了色谱分离的理论基础。掌握基本理论，有利于我们发现色谱行为的内在变化规律，为建立良好的色谱方法提供充分的支持依据。后续笔者将就多组分复杂体系中梯度洗脱的优化进行阐述，敬请期待。