如何解决抗原抗体反复冻融不稳定的问题？

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如何解决抗原抗体反复冻融不稳定的问题？

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来源

https://www.biomart.cn/66755/news/3226098.htm

在生物实验中，抗原和抗体的稳定性对于实验结果至关重要。然而，这些蛋白质在反复冻融过程中容易失去活性，影响实验效果。本文将深入探讨抗原抗体冻融不稳定的原因，并提供切实可行的解决方案。

抗原抗体冻融后不稳定的原因是什么？

抗原抗体的本质是蛋白质，蛋白质的组成单元是氨基酸，一系列氨基酸经过α螺旋和β折叠等形成了复杂的三维结构。结构的稳定性对于抗原抗体的稳定性至关重要，冻融过程中产生的冰晶和温度变化会对蛋白质的结构造成不利影响。底层原理涉及几个关键因素：

冰晶的形成及对蛋白质的影响

冷冻过程中，溶液中的水分子逐渐从溶液中聚集成团，形成冰晶。冰晶具有浓缩效应和界面效应：

浓缩效应：冰晶形成时，溶液中的水分子逐渐凝聚到冰晶中，导致溶液中蛋白质的浓度升高。这种浓缩效应可能会增加蛋白质在溶液中的相互作用，促进蛋白质的聚集和沉淀。
界面效应：冰晶的形成和解冻过程中，液相和固相之间的界面会发生变化。这种界面效应可能会导致蛋白质在界面上的吸附和局部变性。在冰晶解冻时，这种效应可能更为显著，因为冰晶与溶液之间的相变过程可能引起机械应力和蛋白质分子的结构紊乱。

温度的影响

冻融过程中，温度的剧烈变化会对蛋白质的结构和功能产生直接影响。快速的冻结和解冻过程可能导致蛋白质局部结构的失衡和变性，尤其是对于热敏感的蛋白质而言。这种失活通常是由于蛋白质结构的局部不稳定性增加，导致活性位点或功能结构的损伤。

重复冻融的累积效应

多次循环冻融会导致这些影响的累积，加剧蛋白质的损伤和失活。每次冻融过程中可能发生的微小结构变化和损伤，随着时间的推移可能积累到足以显著影响蛋白质的整体稳定性和活性。

稳定剂和保护剂的影响

一些蛋白质需要特定的稳定剂和保护剂来维持其结构和功能。冻融过程中，如果没有添加适当的稳定剂（如甘油、Trehalose等），蛋白质容易失去稳定性。保护剂可以帮助维持蛋白质的天然结构，防止变性和聚集。

抗原抗体冻融不稳定的解决方法

抗原和抗体在反复冻融过程中容易失去活性，解决这一问题可以从多个方面入手。

分装保存

将抗原和抗体分装成小体积的单次使用量，避免反复冻融。根据实验需求，将抗原或抗体分装到小体积的无菌离心管中，例如10-50 µL。每次实验仅取出一管使用，其余部分继续保存在低温条件下。

添加保护剂和稳定剂

在冻存溶液中添加保护剂和稳定剂，可以防止冰晶形成并保护蛋白质结构。常用的保护剂和稳定剂如下：

甘油：甘油可以降低溶液的冰点，减少冰晶在冷冻过程中形成。同时甘油是一种小分子保护剂，可以通过与蛋白质表面的水分子竞争结合，稳定蛋白质的结构，减少冷冻过程中的变性。（添加50%甘油的抗体可以直接存放于-20°C，无需反复冻融。）
蔗糖或海藻糖：蔗糖在冷冻过程中可以形成玻璃态（玻璃化转变），这种无定形的固态可以包裹和稳定蛋白质，防止冰晶对蛋白质结构的损伤。并且蔗糖能够形成一个水化层，保护蛋白质表面，减少冷冻和冻融过程中由于脱水导致的变性。
甘氨酸：甘氨酸可以降低溶液的冰点，从而减缓冰晶的形成。同时具有良好的水合能力，可以与蛋白质分子形成稳定的水合作用，防止蛋白质在冻融过程中由于水分流失而变性。甘氨酸作为一种兼容溶质，在高浓度下可以保持蛋白质的天然结构，同时不干扰蛋白质的功能，也可以提高溶液的玻璃态转变温度（Tg），在高于Tg的温度下，溶液保持玻璃态，可以减少冰晶的形成，从而保护蛋白质结构。
聚乙二醇：PEG 是一种大分子保护剂，通过提供空间位阻，防止蛋白质分子聚集。这种效应可以减少冷冻和冻融过程中由于蛋白质聚集导致的失活。PEG 可以增加溶液的粘度，减少蛋白质分子的运动，从而稳定蛋白质的结构。它还可以通过与蛋白质表面水分子的相互作用，保持蛋白质的水合状态，防止变性。
2-甲基2,4-戊二醇（MPD）：MPD可以干扰冰晶的生长过程，使冰晶形成的速度变慢并减少冰晶的大小。还可以通过与蛋白质分子上的极性基团（如氨基和羧基）形成氢键，稳定蛋白质的二级和三级结构。
牛血清白蛋白（BSA）：BSA作为一种稳定剂，可以通过与其他蛋白质分子形成非共价键，防止它们在冻融过程中变性和聚集。BSA能够覆盖蛋白质的表面，提供一个保护性屏障，减少外界环境对蛋白质结构的破坏。