IF 25+ 单细胞测序揭示胆囊癌发病机制中的微环境动力学和免疫调节因子
IF 25+ 单细胞测序揭示胆囊癌发病机制中的微环境动力学和免疫调节因子
胆囊癌（GBC）是一种具有高致死率的疾病，与持续性炎症密切相关。尽管已知的GBC病理序列，但有限的调查探讨了其生态系统与疾病进展的关系。本研究通过WGS、bulk RNA-seq、scRNA-seq等多组学方法，全面研究胆囊炎、息肉样病变、GBC等胆囊疾病的细胞景观和分子特征，解读疾病进化中的微环境异质性。
摘 要
了解胆囊癌及胆囊良性疾病的复杂生态系统和分子特征，是开展前瞻性癌症预防和优化治疗干预的关键。研究者对来自 15 例 GBCs、4 例胆囊炎、3 例胆囊息肉、5 例胆囊腺瘤和 16 例邻近正常组织的 230737 个细胞进行了单细胞转录组分析。研究结果通过大规模组织学分析、数字空间剖面多路免疫荧光 (GeoMx) 等进行验证。进一步的分子机制被体外和体内研究证实。
细胞图谱揭示了胆囊疾病不同病理状态下免疫格局的改变。GBC 具有更强的抑制免疫微环境，不同亚型的T 细胞增殖模式和巨噬细胞属性不同。值得注意的是，在 GBC 进展过程中，基质细胞和免疫细胞之间的互斥性和显著的基质生态系统(SC)异质性被发现。具体而言，SC1表现出纤维- ICAF和内尖细胞之间的积极相互作用，与不良预后相关。此外，腺癌(AC)内的上皮遗传变异表明腺瘤和AC之间存在进化相似性。重要的是，研究发现上皮细胞中升高的 olfactomedin 4 (OLFM4)是 GBC 进展的核心参与者。OLFM4 与T 细胞功能障碍和肿瘤相关巨噬细胞浸润有关，导致 GBC 预后较差。进一步研究表明，OLFM4 通过 MAPK-AP1 轴上调程序性死亡配体 (PD-L1) 的表达，促进肿瘤细胞免疫逃逸。
这些发现为了解胆囊疾病的发病机制提供了宝贵的资源，并提示 OLFM4 可能是 GBC 的潜在生物标志物和治疗靶点。
文章研究思路及流程：
GBC是一种具有广泛地理流行的高致死率疾病，与持续性炎症密切相关。值得注意的是，GBC的发病并不总是与胆石症相关，息肉样病变，特别是腺瘤，被发现与GBC的进展有关。尽管已知的GBC的病理序列，有限的调查探讨了其生态系统与疾病进展的关系。本研究通过WGS、bulk RNA-seq、scRNA-seq等多组学方法，全面研究胆囊炎、息肉样病变、GBC等胆囊疾病的细胞景观和分子特征，解读疾病进化中的微环境异质性。
数据集选择
全基因组数据(WGS)：EGAS00001003004(146 samples)
转录组数据(bulk RNA-seq)：TCGA Pan-Cancer, EGAS00001003004(115 samples)
单细胞数据(scRNA-seq)：16 samples
生信分析方法
根据文章的分析流程提取所有的分析内容，整理出来就19个分析条目，每个条目都包括分析的内容，这些分析构成了整个文章，本文基于单细胞转录组分析结合实验结果的干湿类文章，下面我们就看看哪些分析可以利用桓峰基因公众号的教程来实现，点击分析条码就会跳转到对应公众号的教程，跟着教程做，您也能发轻松发高分，如下：
单细胞相关分析:
- 单细胞原始数据比对(CellRanger)
- 单细胞数据预处理、PCA and UMAP(Seurat)
- 批量校正及去除(Harmony)
- 克隆扩增和转化的定量分析(scRepertoire)
- 评估scRNA-seq数据中的细胞异质性(ROGUE)
- 恶性细胞异质性分析(cNMF)
- 差异基因富集分析(KEGG)
- 差异基因富集分析(GO)
- 上皮细胞轨迹分析(Monocle2)
- 估计细胞状态及上皮细胞(CytoTRACE)
- 估计细胞转换的方向和速度(velocity.R)
- 识别细胞状态之间的关键分支点和过渡途径(PAGA)
- 细胞-细胞相互作用推断工具(CellPhoneDB)
- 配体-受体相互作用分析(NicheNet)
- 细胞组成的定量相关分析
- 特异性基因标记评分(GSVA)
- 生存分析(Kaplan-Meier)
- 构建Cox回归模型(coxph)
- 绘图相关方法：
散点图 (Scatter)
韦恩图 (Venn)
柱状图 (Barplot)
箱线图 (Boxplot)
折线图 (Lineplot)
直方图 (HistogramPlot)
小提琴图 (ViolinPlot)
相关性矩阵图(Correlation Matrix)
实验验证方法：
OLFM4 knockdown
Real-time quantitative PCR
Western blot
Multiplex immunofluorescence tissue staining
Assessment of T Cell Cytotoxicity
In vitro tumorigenic surrogate analyses
Mouse xenograft models
Mass CyTOF and data processing
GeoMx DSP
研究结果
1. 43例胆囊癌前病变及胆囊癌的scRNA-seq分析
(A)研究设计和样本组成概述。
(B) scRNA-seq队列中样本的临床病理特征。
(C)均匀流形近似和投影揭示了七个主要的细胞谱系。
(D)通过细胞密度图可视化各组间主要谱系组成的变化。
(E)箱形图显示不同组间主要细胞区室的频率。
(F)饼状图说明了不同GBC亚型的主要谱系组成。
(G)64个细胞亚群的表型关系和种群丰度，不包括5个患者特异性集群。
2. 疾病进展过程中免疫细胞状态的表征
(A)UMAP显示T/NK细胞的不同亚群。
(B)T细胞克隆扩增状态显示为细胞计数。
(C)各组间CD3循环的比例。
(D)热图显示按组织亚型分层的每个T亚群的克隆扩增。
(E)热图显示CD8-Tex和其他簇之间的克隆转移，按组织亚型分层。
(F)覆盖在T细胞UMAP上的RNA速度，显示了向CD8-Tex的潜在过渡途径。
(G)UMAP显示循环T/NK细胞亚群。
(H)各组织亚型中循环T/NK细胞亚群比例，分别用饼图和条形图表示。
(I)免疫荧光染色显示与其他两种GBC亚型相比，循环CD8-Tex在AC中占主导地位。
(J)UMAP显示单核细胞、巨噬细胞和DC中发现的髓样细胞亚群。
(K)各组cCD3的比例。
(L)免疫荧光染色证实GBC中存在cCD3。
(N)维恩图显示了GBC中代表TAM的六个重叠基因。
(M)热图显示组织亚型中七个巨噬细胞亚群中功能相关特征基因的不同表达模式。
3. 基质细胞的表型丰度和相互作用
(A)成纤维细胞亚群的UMAP。
(B)内皮细胞亚群的UMAP。
(C)各样本TME子集之间基于相应相对丰度的相关性分析。
(D)根据43个样品的基质细胞组成推断出三种生态型。
(E)TCGA所有癌症类型中SC1和SC3基因特征的生存分析。
(F)Pandey等人对队列中SC1和SC3细胞生态型的反卷积。
(G)SC1和SC3生态型的KEGG富集分析。
(H)小提琴图显示高分化和低分化GBC患者的SC1和SC3特征评分有显著差异。
4. 上皮细胞亚型概括了细胞分化和特异性基因表达的动态
(A)各组间上皮异质性，Shannon熵测量，与其他主要细胞类型。
(B)上皮亚群的UMAP。
(C)肿瘤内表达程序的Pearson相关聚类产生8个元程序。
(D)过渡期间上皮亚型的分布，与假时间一起显示。
(E)上皮的PAGA分析，每个点代表一个上皮簇。
(F)覆盖在UMAP上的RNA速度，描绘了从AC到混合和SCC的潜在过渡路径。
(G)所有上皮细胞的轨迹重建显示出三个分支:前分支、细胞命运一分支和细胞命运二分支。
(H)二维拟时间图显示OLFM4和VIM的动态表达。
5. OLFM4随着GBC的进展而上调，并可在外周血中检测到
(A)点阵图显示OLFM4在上皮亚群中的表达。
(B)点阵图描绘了OLFM4在组织亚型中的表达。
(C)多重免疫组化染色证实了OLFM4在胆囊上皮中的特异性表达。
(D)GBC组织与相应邻近非癌组织的OLFM4表达的Western blot分析。
(E)OLFM4免疫组化染色的代表性图像，与图5F相关。
(F)136例IHC样本中按OLFM4表达水平分层的GBC患者的总生存分析。
(G)胆囊疾病进展过程中血浆中OLFM4的水平。
(H)具有代表性的IHC图像显示OLFM4的分布模式。
6. OLFM4与TAM浸润和体内抗肿瘤T细胞免疫抑制呈正相关
(A)研究GBC空间异质性的DSP检测设计概述。
(B)OLFM4阴性样品和OLFM4阳性样品的代表性图像。
(C)OLFM4表达分层组间差异表达蛋白的火山图。
(D)组间GZMB表达比较的箱形图。
(E)TAM和PD-(L)1信号与OLFM4表达的Pearson相关性。
(F)将GBC-SD CTRL/sh-OLFM4细胞皮下注射至NCG小鼠右侧，与活化的PBMC一起转移，建立异种移植模型。
(G)计算F的肿瘤体积(左)和肿瘤重量(右)。
(H)皮下注射GBC-SD CTRL/sh-OLFM4细胞到CD34+人源化小鼠获得肿瘤异种移植物。
(J)通过飞行时间测定细胞计数法测定H中天真样+ T细胞和记忆样+ T细胞与肿瘤功能标志物的相对表达水平。
7. OLFM4通过MAPK-AP1-PD-L1轴破坏免疫应答
(A)GBC-SD中OLFM4敲低后差异表达基因的火山图。
(B)Western blot检测OLFM4敲低GBC细胞中PD-L1的表达水平。
(C)流式细胞术分析OLFM4敲除的GBC-SD细胞中PD-L1的表达。
(D)流式细胞术检测CD8+T细胞与GBC-SD CTRL/sh-OLFM4细胞共培养72小时后细胞内IFN-γ的变化。
(E)条形图比较CD8+T细胞与GBC-SD CTRL/sh-OLFM4细胞共培养CD107a的相对MFI。
(F)定量RT-PCR检测活化PBMCs与GBC-SD CTRL/sh-OLFM4细胞共培养后的表达。
(G)活化PBMCs与GBC-SD CTRL/sh-OLFM4细胞按4:1比例共培养72小时。
(H)转移酶dUTP缺口末端标记法评估PBMC共培养GBC细胞的细胞凋亡。
(I)IFN-γ+CD8+T细胞与GBC-SD CTRL/sh-OLFM4细胞共培养72小时后的相对比例。
(J)CD107a+CD8+T细胞与GBC-SD CTRL/sh-OLFM4细胞共培养72小时后的相对MFI。
(K)维恩图显示OLFM4刺激或敲除的GBC细胞系中重叠的基因。
(L)Western blot分析复合物和PD-L1水平。
(M)用OLFM4处理GBC-SD后，总复合物和PD-L1水平的Western blot分析。
(N)Western blot分析OLFM4联合或不联合ERK1/2通路抑制剂处理的GBC-SD和NOZ中总复合物和PD-L1水平。
Reference
He H, Chen S, Yu Y, et al. Comprehensive single-cell analysis deciphered microenvironmental dynamics and immune regulator olfactomedin 4 in pathogenesis of gallbladder cancer. Gut. 2024;73(9):1529-1542.