OPA-FMOC联用柱前衍生化法氨基酸类成分测定原理及其在药物分析中的应用

OPA-FMOC联用柱前衍生化法氨基酸类成分测定原理及其在药物分析中的应用

OPA-FMOC联用柱前衍生化法是目前药物分析中测定氨基酸类成分的重要方法之一。本文详细介绍了该方法的原理、操作步骤及其在药物分析中的具体应用，具有较高的学术价值和实用参考价值。

衍生化反应概述及原理

由于大多数氨基酸缺乏天然的紫外或荧光吸收，因此通常需要进行衍生化处理。衍生化方法主要分为柱后衍生化和柱前衍生化两种。

柱后衍生化

该方法多用于离子交换色谱，先通过阳离子交换树脂分离，然后再用茚三酮衍生化，在可见光区检测。1951年Moore和Stein研制出了第一台氨基酸分析仪，将未衍生的氨基酸用离子交换色谱分离后，用茚三酮进行柱后衍生，在可见光区检测。1958年由Beckman开发并推出了全自动分析仪。新一代的氨基酸分析仪已将分析时间缩短到大约110分钟。但是，因为需要专门的仪器，且仪器价格昂贵（如德国曼默博尔公司A300全自动氨基酸分析仪参考价约100万RMB），这大大限制了该方法的推广应用。

柱前衍生化

该方法多用于液相色谱，先用衍生试剂与氨基酸进行衍生化反应，然后再用紫外或荧光检测器检测。柱前衍生试剂种类较多，且各方法均有其优缺点，还没有一种很完善的柱前衍生试剂。现在大多以OPA法、FMOC法和AQC法为主。

OPA-FMOC联用柱前衍生化法

OPA柱前衍生化法

原理：OPA在3-巯基丙酸的存在下与氨基酸反应

优点：过量衍生试剂不干扰检测

缺点：

1. 不能与二级氨基酸（如脯氨酸）反应
2. 衍生试剂本身不稳定，易氧化变质
3. 338nm处无吸收

1971年由Roth首次提出用OPA对氨基酸进行柱前衍生。

FMOC柱前衍生化法

原理：

优点：可同时与一级和二级氨基酸反应

缺点：

1. 衍生试剂本身（FMOC-Cl）及其水解产物（FMOC-OH）对检测有干扰
2. 266nm处有吸收

OPA-FMOC联用柱前衍生化法

让样品先与OPA试剂充分反应，将一级氨基酸全部反应完全，接着样品中剩余的二级氨基酸再与FMOC反应。由于FMOC、FMOC衍生物和反应副产物比任何OPA衍生物的疏水性都强，所以它们不会干扰任何一级氨基酸的检测。因为只有几种FMOC衍生物，所以可以使用简单的梯度将这些氨基酸与反应副产物和FMOC分离。1986年惠普/安捷伦将OPA和FMOC衍生反应依次结合，实现了氨基酸的全自动衍生、色谱分离和检测。

流动相及衍生试剂的配制

流动相的配制

• A相：0.02M NaAc 2L，THF 7mL，TEA 400uL
• B相：0.02M NaAc 200mL，ACN 400mL，MeOH 400mL
• PH值调节至7.20±0.05

衍生试剂的配置

衍生试剂可以从安捷伦公司直接购买，1mL安瓿瓶包装，即开即用，但价格较为昂贵；自行配制时，因衍生反应纯度要求较高，需购买Sigma原装试剂，包括OPA(邻苯二甲醛)、FMOC-Cl(芴甲氧酰氯)和MPA(3-巯基丙酸)。

柱前自动衍生过程

1. 从1号瓶中吸取0uL水
2. 从3号瓶中吸取5uL硼酸钠-氢氧化钠缓冲液（衍生反应所需的环境，PH值在10.5左右）
3. 从1号瓶中吸取0uL水
4. 从4号瓶吸取1uLOPA试剂
5. 从1号瓶中吸取0uL水
6. 从6号瓶吸取样品1uL，充分混合约2min
7. 从1号瓶中吸取0uL水
8. 从5号瓶抽取FMOC试剂1uL，充分混合约2min
9. 从1号瓶中吸取0uL水
10. 从2号瓶吸取水32uL，以最大速度充分混合3次，然后进样

应用实例：注射液中氨基酸含量的测定

色谱条件

• 色谱柱：Agilent SB-C18柱（4.6mm×250mm,5um）
• 流动相梯度：
• 0.00min：1.0%
• 2.00min：22.0%
• 15.00min：22.0%
• 30.00min：70.0%
• 35.00min：70.0%
• 38.00min：100.0%
• 49.00min：100.0%
• 52.00min：0.0%

样品配制

1. 氨基酸混合标准品溶液的配制：精密称取各氨基酸标准品5-10mg，一起置入容量瓶中，用1%盐酸溶液溶解，并定容至100mL。用0.45um针头滤器滤过，即得。
2. 游离氨基酸供试液的配制：取各注射剂原液，直接用0.45um针头滤器滤过，即得。
3. 水解氨基酸供试液的配制：取各注射液1mL于带盖试管中，加入6mol/L盐酸溶液9mL，充氮气封口，盖紧瓶盖，置于110℃恒温干燥箱中水解24h，取出后将样品倒入蒸发皿中，70℃水浴中蒸干，然后加入1%盐酸溶液2mL，超声10min，用0.45um针头滤器滤过，即得。

结果分析

• 精密度考察结果显示混合标准品精密度良好
• 稳定性考察显示混合标准品在0h、2h、4h、8h、12h、24h内稳定性良好
• 线性关系考察显示各氨基酸在各自浓度范围内线性关系良好

试验注意事项

1. 实验中需要使用到的仪器设备包括：高效液相色谱仪、氮吹仪、恒温干燥箱等。
2. 实验中使用的化学试剂需要严格控制纯度，建议使用Sigma原装试剂。
3. 实验中需要严格控制pH值，这是影响实验结果的关键因素。
4. 实验中需要严格控制衍生化反应的时间和温度，以确保反应完全。
5. 实验中需要严格控制流动相的配制，每次实验前要根据实际情况，对梯度进行微调。