结核分子细菌负荷（TB-MBLA）用于结核病诊断和治疗效果监测准确性的研究
结核分子细菌负荷（TB-MBLA）用于结核病诊断和治疗效果监测准确性的研究
结核分子细菌负荷测定法（TB-MBLA）是一种新的基于RNA的检测方法，可以检测和定量痰中活的结核分枝杆菌。2018年，世卫组织（WHO）推荐TB-MBLA作为一种分子检测方法，可以替代涂片和培养，以监测结核病治疗效果。TB-MBLA特异性地检测结核分枝杆菌中丰富的16S核糖体RNA，有极高的灵敏度。
这项研究首次比较了基于核糖体RNA的检测方法（TB-MBLA）和基于DNA的检测方法（Xpert-Ultra）与金标准MGIT（Mycobacteria Growth Indicator Tube）培养法相比，在肺结核诊断及治疗效果监测（6个月）的性能差异。
研究设计和参与者入组标准
这项纵向前瞻性研究中，纳谷鲁中乌友好医院招募了18 岁或18岁以上的疑似肺结核患者，咳嗽至少2周，伴或不伴发烧，有盗汗和体重减轻（体重减轻≥5%），入组流程见图1。
参与者提供两份即时痰，入组时（0周）将两份痰液混合并用磁力搅拌器进行均质化，将均质化的痰液等分成四份1mL，分别用Xpert-Ultra、痰涂片和痰培养（MGIT）以及TB-MBLA进行检测。
将痰培养（MGIT）作为参考标准，比较TB-MBLA，Xpert MTB/RIF Ultra（Xpert-Ultra）和痰涂片在结核诊断及治疗效果监测（6个月）的性能差异。Xpert-Ultra检测结果呈阳性且没有利福平耐药证据的参与者将接受为期6个月的标准抗结核治疗，并在开始治疗后的第 2、8、17和26周后再次取样，并用上述4种方法进行检测，以监测治疗反应。在治疗第26周（第6个月）仍为Xpert-Ultra阳性的患者在治疗后3个月进行电话随访。
图1.入组流程
基线人口统计学特征
在2019年11月15日至2022年6月15日期间，236名患者中有15名（6%）无法在预定的就诊点返回诊所，10名（4%）拒绝参与研究，1名（<1%）无法咳痰。因此，在基线时，有210名（89%）筛查患者入组，其中有4人（2%）在纳入研究前的12个月内有结核病治愈史。如图表1显示的是基线人口统计学数据和临床特征。
表1. 基线人口统计学数据和临床特征
经金标准痰培养结果为阳性或阴性的入组者。
n=210是指在所有参与者中痰培养阳性或阴性的总数。
P值是在痰培养阳性和阴性的参与者之间的比较。
§仅对HIV感染者进行测量（n=72）
诊断性能比较
研究者首先比较了治疗前和金标准检测（痰培养）方法相比，Xpert-Ultra、痰涂片以及TB-MBLA诊断性能的差异。
金标准检测（痰培养）检测出103人（49%）阳性，TB-MBLA检出113（54%）人阳性。两者共同检测出101名阳性，表明这两种检测方法在灵敏度上一致性较高。Xpert-Ultra检测出129人（61%）阳性（纳入治疗监测组），在Xpert-Ultra检测呈阳性的15例（7%）病例中，TB-MBLA和MGIT培养结果一致检测为阴性，表明TB-MBLA和MGIT检测方法的特异性一致。
表2. TB-MBLA、Xpert-Ultra和痰涂片的诊断性能
治疗前TB-MBLA和Xpert的诊断灵敏度相似（均为99% ），但TB-MBLA的特异性（90%）高于Xpert-Ultra（78%）。TB-MBLA和Xpert-Ultra的灵敏度均高于痰涂片（75%，77/103），但痰涂片的特异性（98%，99/101）高于TB-MBLA和Xpert-Ultra。在痰涂片阴性或合并HIV感染者中，TB-MBLA的敏感性、特异性、PPV和NPV分别和总人群基本一致。
“痕量阳性”样本结果比较
研究者分析了基线时Xpert-Ultra检测结果为“痕量阳性”的10名参与者的其它检测结果，其中8人（80%）的 TB-MBLA和MGIT培养结果均为阴性，2名痕量阳性参与者的TB-MBLA和MGIT均呈阳性，并对治疗做出了反应。因此痕量阳性结果来自存活或死亡的细菌仍不清楚。此外，40%的痕量阳性参与者在基线时曾有结核病治愈史，这表明可能存在结核杆菌的残留DNA。这也解释了Xpert-Ultra特异性较低的原因。
6个月治疗期间不同检测方法测定结核病阳性率变化
图2. 6个月治疗期间不同检测方法阳性率变化
接着，研究者分析了6个月治疗期间不同检测方法阳性率的变化情况。结果表明所有检测方法都显示出对治疗的反应，表现为第2周时检测阳性率下降。
在8周时（n=113），检测阳性率也有所下降，但Xpert-Ultra阳性率（74%）下降趋势远低于TB-MBLA（18%），痰涂片（12%）和痰培养（11%）。
到治疗结束，Xpert-Ultra检测阳性率的下降速度明显较慢；因而在第26周时95人中有31人（33%）的Xpert-Ultra检测结果仍为阳性，而痰涂片阳性的有6人（6%），TB-MBLA或痰培养结果全部阴性。
Xpert-Ultra检测到31个阳性样本的半定量分级各不相同，这些参与者在这阶段均未表现出临床症状，在治疗后3个月的随访中，有两名患者的Xpert-Ultra检测结果仍然呈阳性。
表4. 治疗期间检测阳性率和细菌负荷的变化
研究者进一步解释了治疗过程中阳性率下降的原因是细菌载量的减少。与基线时的细菌载量相比，TB-MBLA 测得的平均细菌载量在第2周、第8周、第17周时分别减少了1.4log10 eCFU/mL、2.3log10 eCFU/mL和2.6 log10 eCFU/mL，在第26周时降低为0。且TB-MBLA菌载量与痰培养阳性时间相关。
Xpert-Ultra的阳性率呈线性下降趋势，而不是通过痰涂片、MGIT培养，TB-MBLA等方法显示的非线性（双相）的方式（图2），和先前的研究一致。
随着治疗的进行，TB-MBLA的总体灵敏度（表2）降至84%，而特异性则保持不变。同样，痰涂片的灵敏度降至66%，而特异性则从基线时的 98%降至94%。相比之下，Xpert-Ultra的总体灵敏度仍然高达97%，但特异性却下降到46% ，这表明Xpert-Ultra的转阴表现延迟。
模拟PCR Cq值的时间变化来估算结核杆菌DNA和 rRNA的体内消除率
接着研究者为了解释Xpert-Ultra阳性率在治疗结束时仍然很高的原因，通过指数饱和函数模拟PCR Cq值的时间变化来估算结核分枝杆菌DNA和rRNA的体内消除率。结果表明TB-MBLA 16S rRNA达到Cq 40（定量极限）的中位数时间为15.7周（蓝色虚线），Xpert-Ultra基因达到Cq 40的中位数时间为51.6周（红色虚线）。表明结核分枝杆菌rRNA的降解速度快于DNA。基于DNA的Xpert-Ultra的转阴率比基于rRNA的TB-MBLA转阴率慢3.3倍。
图3. 分别测定TB-MBLA和Xpert-Ultra Cq值的增长率（反应rRNA或DNA的清除率）
A.Xpert-Ultra测定的DNA与TB-MBLA测定的16S rRNA比较。
B.Xpert-Ultra与TB-MBLA测定的16S rRNA所测基因的中位数。
当16S rRNA或DNA的浓度低于检测限时，Cq值定义为Cq40。Cq为定量的循环数。
第8周痰涂片结果与治疗效果之间的相关性
最后研究者评估了第8周的痰涂片结果与治疗效果之间的相关性，进一步证实了痰涂片的低敏感性和作为延长强化期治疗证据的不足。
表5 .第8周时阳性病例的6个月的治疗结果
如上表所示，在治疗第8周时（n=113），20名（18%）参与者TB-MBLA阳性，其中有6名（30%）痰涂片检测阳性。84名（74%）Xpert-Ultra阳性，其中13（15%）痰涂片检测阳性。只有8周时痰涂片阳性的参与者额外接受1个月的强化期治疗，然后转为继续治疗阶段。患者无论是否接受1个月额外的强化治疗，治疗成功率相似。治疗结束后3个月的电话随访显示这些患者均未出现类似结核病的症状。
此外，113名参与者中有100人（88%）在8周时痰涂片结果为阴性，其中14人（14%）TB-MBLA检测为阳性。痰涂片遗漏了14名TB-MBLA阳性的参与者，证实了其低敏感性。
研究点评
尽管结核病可预防可治愈，但结核病仍然是全球发病率和死亡率的一个主要原因。2021年，估计有1060万人患有结核病，160万人死于肺结核。结核病治疗方案漫长而艰巨，可能与不良反应和显著的经济成本增加相关，这将对依从性和治疗结果产生负面影响。在全球范围内，2020年开始接受结核病治疗的人中只有86%成功完成了结核病治疗。监测结核病治疗，以确定那些有不良结果风险的患者，可以提高整体治疗的成功率。WHO目前建议在治疗开始后两个月和治疗的最后一个月进行痰涂片和分枝杆菌培养检测，以监测治疗效果。然而，这些方法也有局限性。痰涂片对预测治疗效果的诊断准确性较差；而痰培养对基础设施和成本的要求高，周转时间慢，且预测复发的敏感性差。即使结合体重、临床症状和胸片等其他指标，其表现也很差，仍然需要准确的方法，以确定结核病已治愈的人。
这项研究首次比较了基于核糖体RNA的检测方法（TB-MBLA）和基于DNA的检测方法（Xpert-Ultra）在肺结核诊断及治疗效果监测（6个月）的性能差异。此研究展示了TB-MBLA和Xpert-Ultra具有相似的诊断灵敏性，但TB-MBLA具有更高的特异性。Xpert-Ultra的特异性比TB-MBLA低13%，可能是大量“痕量阳性”结果降低了Xpert-Ultra的特异性。10个治疗前痕量阳性的样本，有8个（80%）在MGIT和TB-MBLA检测中均为阴性。这些发现可能表明，如果根据痕量阳性结果进行治疗，可能会造成过度诊断或治疗。研究进一步证明了Xpert-Ultra和痰涂片在监测结核病治疗效果方面的局限性。当使用Xpert-Ultra监测治疗反应时，由于死亡杆菌 DNA的积累，特异性大大降低，因为即使治疗成功，PCR仍可能呈阳性反应。Xpert-Ultra虽然是一种灵敏的结核病诊断工具，但不适用于治疗效果的监测。治疗两个月结束时，痰涂片漏检了14名TB-MBLA阳性的参与者，这进一步证实了痰涂片的灵敏度较低，此项研究结果支持世界卫生组织的建议，即不建议将2个月疗程结束时痰涂片阳性结果作为延长强化治疗阶段的依据。TB-MBLA在治疗开始前后的高敏感性和特异性，使其比涂片镜检和Xpert-Ultra具有相对优势。TB-MBLA与MGIT培养在结核病治疗效果监测结果一致性高，而且TB-MBLA结果是定量的，而且比MGIT培养更快（以小时为单位，而不是以天或周为单位）。超过80%的患者在治疗第2个月时经TB-MBLA检测转为阴性，并在治疗结束前一直保持阴性，这表明TB-MBLA在结核病的个性化管理中具有预后效用和适用性。部分患者治疗前菌载量低，在第14天就转为阴性且在整个治疗随访期间保持阴性，可能不需要6个月的疗程。
本研究的优势在于，它嵌套于规模更大的纵向“I AM OLD（Inflammation, Aging, Microbes, and Obstructive Lung Disease）”研究队列中，由一个经验丰富的团队指导收集高质量的数据，而且参与者在结核病治疗过程中的保留率很高。此外，没有数据因Xpert-Ultra检测无效或不确定而丢失，培养污染率为2.5%，比实验室的平均污染率（8%）低2.5倍。本文依然存在一定局限性，例如将痰培养作为分子诊断的参考标准，未来的研究可以使用敏感性和特异性校正方法或复合参考标准。另一个限制是在一个基于单中心的仅纳入210名参与者的样本量，这可能不足以支持检测方法间差异的分析。特别是在2个月治疗结束时，痰涂片阳性的患者较少，因而在分析2个月痰涂片检测结果和治疗效果的相关性的时候，会产生较大偏倚；未来需要更多的前瞻性研究以及更大的样本量支持这一结论。
▌参考文献：
（1）Musisi E, Wamutu S, Ssengooba W, et al. Accuracy of the tuberculosis molecular bacterial load assay to diagnose and monitor response to anti-tuberculosis therapy: a longitudinal comparative study with standard-of-care smear microscopy, Xpert MTB/RIF Ultra, and culture in Uganda. Lancet Microbe. 2024;5（4）:e345-e354. doi:10.1016/S2666-5247（23）00367-1
（2）Gupta-Wright A, den Boon S, MacLean EL, et al. Target product profiles: tests for tuberculosis treatment monitoring and optimization. Bull World Health Organ. 2023;101（11）:730-737. doi:10.2471/BLT.23.290901